دانلود مقاله میکروسکوپ فاز کنتراست

مقدمه احتمالا مهمترین پیشرفتی که در تکنیک میکروسکوپی در سالهای قبل از 1960 حاصل شد توسعه میکروسکوپهای فاز کنتراست و تداخلی بود.

در این نوع میکروسکوپها بافتهای زنده را در حالی که ثابت نشده‌اند (unstained) می‌توان با کانتراست خوب و رزولوشن مناسب مشاهده نمود.

برای آنکه بتوان جزئیات یک شیئی را قابل رویت نمود.

این عمل را با رنگ آمیزی می‌توان انجام داد.

در صورتی که شیئی مورد نظر رنگ آمیزی نشده (unstained) باشد می‌توان بدون دخالت در ساختمان یا حیات آن شیئی ضریب انکسار قسمتهای متعددی از آنرا کم یا زیادتر از ماده‌ای که شیئی در آن قرار دارد نمود.

در صورتی که اختلاف ضریب شکستها خیلی کم باشد.

به گونه‌ای که قابل مشاهده نباشد می‌توان از میکروسکوپ زمینه تاریک استفاده نمود.

میکروسکوپ زمینه تاریک عمدتا نشان دهنده لایه‌های سطحی نمونه بجای ساختمان داخلی می‌باشد.

علاوه بر آن لازمه این سیستمها استفاده از لامپهای با قدرت زیاد می‌باشد که بعضا وقتی که مدت زمان مشاهده زیاد باشد بایستی از سیستم خنک کننده استفاده شود.

این در حالی است که میکروسکوپ فاز – کنتراست دارای این اشکالات نمی‌باشد و می‌توان ساختمان داخلی شیئی را بخوبی مشاهده نمود.

در حالت کلی بخشهایی از شیئی که دارای ضرائب انکسار زیادتر باشند در مقایسه با زمینه روشنتر تاریک و یا بلعکس می‌باشد که البته این مطلب بستگی به نوع سیستم – منفی یا مثبت بودن میکروسکوپ دارد.

لامپ نوری مورد استفاده در این نوع میکروسکوپ یک لامپ معمولی می‌باشد و همه دهانه عدسی شیئی در تشکیل تصویر شرکت می‌نمایند.

در این نوع میکروسکوپ و رزولوشن نسبت به زمینه تاریک ضعیفتر است و این بخاطر پدیده شکست نور و تغییر فاز آن می‌باشد.

اصول کلی هدف از این میکروسکوپها قابل دیدن نمونه‌هائی است که موجب تغییر قابل توجهی در شدت (دامنه) نور عبوری از آن مثل حالت نمونه‌های رنگ آمیزی شده (stained) نمی‌باشد.

تنها تغییری که اجزاء مختلف این گونه نمونه‌ها بر روی نور عبوری بوجود می‌آورند آن است که موجب تغییر در فاز آنها می‌شود.

به عبارت دیگر در روشهای میکروسکوپهای معمولی سیستم ساختمانی نمونه به گونه‌ای است که اجزاء مختلف آن دارای خاصیت جذب متفاوت نور برخوردی به آنها می‌باشد و بدین لحاظ نور عبور کرده از نمونه در قسمتهای مختلف دارای شدتهای مختلفی می‌باشند که این تغییر در شدت بستگی به مقدار جذب در قطعات و اجزاء مختلف نمونه وارد و بنابراین ناحیه‌ای که جذب کمتر اتفاق می‌افتد تصویر شیئی روشنتر و بخشهای با جذب بیشتر تاریکتر مشاهده می‌شوند.

در این نمونه‌ها تصویر از نور عبور نموده از نمونه تشکیل می‌شود.

بسیاری از نمونه‌ها شدت نور عبور نموده را تغییر چندانی نمی‌دهند و لیکن اجزاء مختلف موجب تغییر فاز نور عبور نموده از آنها می‌شوند و لیکن با توجه به آنکه چشم حساس به فاز یا تغییر فاز نمی‌باشند لذا بایستی به نحوی این تغییر فاز را قابل مشاهده نمائیم.

بنابراین هدف از میکروسکوپ فاز کنتراست تبدیل تغییر فاز به تغییر دامنه است که بتواند بوسیله چشم قابل مشاهده شود.

وقتی که نور از کندانسور عبور نموده و به شیئی برخورد نماید در آن صورت به دلیل پدیده تفرق حاصله در اثر جسم طیف تفرق یافته در پشت عدسی چشمی حاصل می‌شود.

با توجه به آنکه جسم مثل یک شبکه متفرق کننده عمل می‌نماید در آن صورت تصویر در این شبکه در اثر تفرق در پشت عدسی چشمی ایجاد می‌شود.

تصویر حاصله که نشان دهنده جزئیات جسم است در اثر ترکیب نور متفرق شده و نور عبور نموده بدون تفرق ایجاد می‌شود.

به علت آنکه بین نور متفرق شده و نور عبور نموده بدون تفرق ایجاد می‌شود.

به علت آنکه بین نور متفرق شده و نور مستقیم اختلاف فاز وجود دارد لذا این دو نوع پرتو با همدیگر ترکیب شده و تداخل انجام می‌شود و در نتیجه اختلاف فاز این دو نوع نوز ایجاد تغییر در دامنه یا شدت نور در صفحه تصویر می‌نماید.

میکروسکوپهای فاز – کنتراست بگونه ای طراحی شده اند که تغییر فاز حاصله در اثر وجود نمونه و تغییر فاز در اثر تغییر ضریب شکست در اجزاء مختلف آن این تغییر فاز به تغییر شدت تبدیل شود.

در صورتی که نورهای عبور نموده از جزهای مجاور همدیگر دارای اختلاف فاز ناچیز باشند در آن صورت اختلاف فاز بین تقریبهای صفر و یک برابر λ 4/0 خواهد بود.

در آن صورت به دلیل این اختلاف فاز نور ترکیب شده ، تشکیل نوارهای تداخلی می‌نماید.

حال اگر توجه نمائیم نور عبور نموده از طرف دیگر نیز به همین شکل دارای اختلاف فاز ولی در جهت عکس همدیگر می‌شوند و لذا نور رسیده به آن نقطه صفر می‌باشد و بنابراین ساختمان شیئی قابل رؤیت نمی‌باشد.

در میکروسکوپهای فاز کنتراست تأثیر یک مانع با ضخامت λ 4/0 آن است که موجب هم فاز ساختن نوارهای تداخلی از دو طرف شود و در نتیجه افزایش دامنه حاصل می شود.

سیستم ساختمانی یک میکروسکوپ فاز کنتراست استاندارد به گونه‌ای است که یک روزنه دایره ای شکل در محل صفحه کانون کندانسور substage وجود دارد که شیئی بوسیله یک دسته پرتو مخروطی شکل روشن می‌شود.

تویر مستقیم این دایره روشن بوسیسله عدسی شیئی در محل کانون F عدسی شیئی تشکیل می‌شود.

همچنین روی این صفحه تصویرهای متفرق شده بوسیله شیئی و ساختمان داخلی شیئی بر روی این صفحه تشکیل می‌شود.

البته تصویر بر روی این صفحه تشکیل می‌شود و تصویر متفرق شده از محل مربوطه بر روی این صفحه F جابجا می‌گردد.

در محل کانون F یک صفحه قرار دارد که این صفحه وظیفه‌اش آن است که به اندازه λ 4/0 بین دو دسته پرتوئی که بطور مستقیم از شیئی عبور نموده و دسته پرتوئی که متفرق شده است اختلاف فاز ایجاد می‌نماید.

امواج متفرق شده و عبور کرده بطور مستقیم از صفحه در محل کانون شیئی با همدیگر ترکیب و موجب ایجاد نوارهای تداخلی با شدت ماکزیمم و مینیمم می‌نماید و در نتیجه این عمل ذره‌ای که در داخل جسم قرار دارد در صورتی که ضریب انکسار آن بیشتر از ضریب انکسار ناحیه مجاورش باشد بصورت یک منطقه تاریک ظاهر می‌شود.

در صورتی که صفحه فاز (phase-plate) موجب جلو انداختن فاز موج عبوری به اندازه λ 4/0 باشد در آن صورت تصویر نقطه تاریک (positive phase plate) و در صورتی که موجب عقب انداختن نور بدون برخورد به اندازه λ 4/0 شود.

تصویر نقطه بصورت روشن (negative phase contrst) ظاهر می‌شود.

پس از ابداع این نوع میکروسکوپ بزودی مشخص شده که اگر صفحه‌ای که جاذب نور است بر روی حلقه صفحه تغییر دهنده فاز قرار بگیرد بطوری که دامنه موج مستقیم عبوری از آن کمی تضعیف شود در آن صورت تصویر حاصله به حد زیادی بهتر می‌شود.

ملزومات یک میکروسکوپ فاز – کنتراست علاوه بر اجزاء اصلی یک میکروسکوپ معمولی ، یک میکروسکوپ فاز کنتراست همچنین دارای اجزاء زیر می‌باشد: این میکروسکوپ دارای چشمه نور قوی می باشد که نور آن از طریق یک حلقه بر کندانسور حلقه دیافراگم روشنایی کندانسور صفحه شیئی نور مستقیم نور پراکنده شده عدسیهای شیئی صفحه تصویر با میکروسکوپها لازم است که حلقه‌هایی با اندازه‌های متفاوت همراه باشد به گونه‌ای که با هر عدسی شیئی دیافراگم مناسب استفاده شود.

به عنوان مثال یک دیافراگم با قطر کوچک با عدسی شیئی 16 میلیمتری و یک دیافراگم با قطر بزرگ با عدسی شیئی 2 میلیمتری استفاده می‌شود.

موقعیت محل دیافراگم در پشت کندانسور به گونه‌ای است که تصویر آن در محل کانون عقبی عدسی شیئی تشکیل می‌شود.

علاوه بر آن بایستی میکروسکوپ دارای عدسیهای شیئی مخصوص باشند.

این عدسی‌ها مثل عدسیهای شیئی معمولی می‌باشند با این تفاوت که دارای یک صفحه فاز (phase palate) در محل کانون عقبی آن در محل تصویر دیافراگم می‌باشند.

صفحه فاز یک صفحه شیشه‌ای می‌باشد که دارای ناحیه دایره‌ای با ضخامت کمتر در محل ویژه‌ای بر روی آن (negative) یا برآمدگی (positive) می‌باشد.

ضخامت این ناحیه به گونه‌ای است که موجب ایجاد تقدم یا تأخیر فاز در نوری که از آن می‌گردد نسبت به نوری که از ضخامت بیشتر مجاورش عبور می‌کند می‌شود.

معمولا سه نوع عدسی شیئی در سیستمهای فاز کنتراست وجود دارد این عدسیها بر حسب اختلاف در کنتراست از همدیگر متمایز می‌شوند و عبارتند از: a) عدسیهای شیئی DL,DM: این دو نوع عدسی در حالت زمینه روشن بکار می‌روند.

استفاده از این عدسیها موجب ایجاد تصویر تاریکی از نمونه در زمینه نسبتا روشن می‌شود.

استفاده از عدسی DM موجب جذب متوسط نور مستقیم می‌شود و لذا زمینه تا حد متوسطی روشن می‌باشد.

استفاده از عدسی DL موجب جذب کمی از نور مستقیم می‌شود و لذا موجب ایجاد زمینه روشنتری نسبت به استفاده از عدسی DM می شود.

b) عدسیهای شیئی BM: این نوع عدسی در حالت زمینه تاریک استفاده می‌شود.

نکته قابل توجه در مورد عدسیهای شیئی مورد استفاده در میکروسکوپهای فاز کنتراست دامنه عمل آنها می‌باشد.

در میکروسکوپهای زمینه روشن وقتی اختلاف فاز نورهای عبوری افزایش یابد تصویر تاریکتر می‌شود.

اگر اختلاف فاز از حد معینی بیشتر شود تصویر روشن به روشن شدن می‌نماید تا اینکه دارای روشنائی با زمینه خواهد شد.

در این حالت دیگر تصویر قابل دیدن نخواهد بود.

بنابراین بایستی توجه داشت که اختلاف فاز مجاز در این میکروسکوپها برای مشاهده تصویر دارای حد معینی است.

محدوده قابل تغییر برای آنکه تصویر قابل مشاهده باشد را دامنه عمل می‌نامند.

هر چقدر دامنه عمل بیشتر باشد برای مشاهده تصویر مناسبتر است.

عدسیهای شیئی DL دارای دامنه عمل زیاد می‌باشند.

استفاده از عدسیهای شیئی با دامنه عمل زیاد در مواردی توصیه می‌شود که اختلاف فاز نمونه خیلی کم می‌باشد این عدسی ها موجب افزایش کنتراست می‌شود.

عدسیهای DM دارای دامنه عمل کم می‌باشد.

با میکروسکوپها لازم است که حلقه‌هایی با اندازه‌های متفاوت همراه باشد به گونه‌ای که با هر عدسی شیئی دیافراگم مناسب استفاده شود.

استفاده از عدسیهای شیئی با دامنه عمل زیاد در مواردی توصیه می‌شود که اختلاف فاز نمونه خیلی کم می‌باشد این عدسیها موجب افزایش کنتراست می‌شود.

c) یک تلسکوپ کناری جهت مشاهده تصویر ایجاد شده در کانون عقبی شیئی لازم است.

موقع استفاده از این تلسکوپ به جای عدسی چشمی معمولی قرار گیرد، این تلسکوپ را بایستی جهت تنظیم میکروسکوپ بکار برد.

در صورتی که این تلسکوپ را با عدسی چشمی جایگزین نمائیم تصویر حلقه فاز و دیافراگم حلقوی قابل رؤیت خواهد بود.

در صورتی که این دو تصویر بر هم منطبق نباشند با استفاده از پیچهای مربوطه می‌توان این دو را تنظیم نمود.

d) هنگام مشاهده نمونه‌ها با میکروسکوپهای فاز کنتراست اغلب بخاطر آنکه حساسیت چشم انسان به طول موجهای بیشتر است از فیلتر سبز استفاده می‌شود.

طول موجهای مذکور بسادگی از این فیلتر عبور می‌نمایند و وضوح تصویر بیشتر خواهد بود.

این فیلترها موجب ایجاد راحتی بیشتری برای مشاهدات طولانی نیز می‌شوند.

علاوه بر این فیلترها اغلب مناسب است که از فیلترها IR نیز جهت جذب گرما استفاده زیرا شدت نور مورد استفاده بسیار زیاد است و می‌تواند موجب آسیب به نمونه در اثر گرما شود.

روش استفاده از میکروسکوپ فاز – کنتراست نحوه کار با میکروسکوپ فاز – کنتراست در انواع مختلف آن متفاوت است و لذا بایستی بر اساس دستورالعمل کارخانه سازنده عمل نمود و لیکن در اکثر آنها نحوه کار با آن به شرح زیر می‌باشد: لامپ را روشن نموده و سپس به تدریج شدت آنرا تا نصف یا 4/3 شدت ماکزیمم افزایش دهید.

روزنه لامپ و کندانسور substage را کاملا باز نمائید.

امتحان نمائید که فیلتر نوری در محل خود بطور مناسب واقع است.

حلقه‌هایی که در زیر کندانسور واقع است را کنار بزنید.

در ابتدا با استفاده از عدسی شیئی با توان بالا (mm 4 عدسی شیئی خشک) شروع نمائید.

فوکوس سیستم را تنظیم نموده به گونه‌ای که شیئی و stage را بخوبی بتوان تفکیک نمود.

پس از آن عدسی شیئی را به موقعیت مربوطه‌اش منتقل نمائید.

کندانسور زیر stage را بگونه‌ای تنظیم نمائید که حدود 5 میلیمتر زیر stage واقع شود.

اسلاید را که حاوی نمونه است و همچنین لامپ آن را بر روی stage قرار دهید به گونه‌ای که فیلم به سمت بالا واقع شود.

با فشار کمی بر روی اسلاید اتصال یکنواختی با stage فراهم آورید.

تصویر را فوکوس نموده و همچنین توجه شود که در وجود حباب بتوان آنرا مشاهده و سپس حذف نمود.

جهت فوکوس نمودن اگر خطی بر روی اسلاید قرار دارد و یا آنکه در صورت نبودن می‌توان از خود نمونه برای فوکوس نمودن استفاده نمود.

عمل فوکوس کردن با یستی بدقت انجام شود.

یکی از عدسیهای چشمی را برداشته و بجایش تلسکوپ مربوطه را بگذارید.

با حرکت دادن آن ، آنرا برای صفحه فاز در بالای عدسی شیئی فوکوس نمائید.

فوکوس میکروسکوپ را تغییر نداده و توسط چشمی کنترل کندی که فوکوس آن تغییر نکرده است.

صفحه دیافراگم مناسب عدسی شیئی مورد استفاده را در محل خود بین کندانسور و لامپ قرار دهید.

سپس کندانسور را فوکوس نمائید بگونه‌ای که تصویر حلقه روشن از داخل تلسکوپ برابر با حلقه روی صفحه فاز باشد.

مجددا از طریق چشم دیگر که هنوز در محل خودش قرار دارد ببنید که هنوز تصویر فوکوس می‌باشد.

با کنار زدن دیافراگم مجددا به داخل تلسکوپ نگاه نموده و با تغییر پیچهای مربوط به کندانسور آنرا بگونه‌ای تنظیم نمائید که تصویر فیلمان بطور واضح روی حلقه مربوط به صفحه فاز قرار گیرد.

دیافراگم را مجددا به محل خود برگردانید در حالی که بداخل تلسکوپ نگاه می‌کنید و سپس دیافراگم را به مرکز بوسیله پیچهای مربوطه منتقل نمائید.

حلقه روشن بایستی دقیقا در بین حلقه‌های صفحه فاز قرار گیرند.

لبه‌های این دو بایستی بر روی همدیگر بیفتد و در ضمن بایستی برنگ سفید باشد و نه رنگ دیگر.

اندازه حلقه نوری را می‌توان با تنظیم فوکوس کندانسور تنظیم نمود.

مجددا از طریق عدسی چشمی که هنوز در محل خود قرار دارد به نمونه نگاه کرده و امتحان کنید که هنوز سیستم فوکوس می‌باشد.

در صورت لزوم بایستی فوکوس را تنظیم نمود.

در این حالت با نگاه به داخل تلسکوپ مجدددا حلقه نور را تنظیم نمائید.

تلسکوپ را خارج نموده و مجدددا عدسی چشمی دوم را سر جایش بگذارید.

نمونه را مورد مطالعه قرار داده ضمن آنکه در صورت نیاز بایستی نور را نیز تنظیم نمائیم با حرکت دادن نمونه می‌توان ضخامتها و نواحی مختلف نمونه را بررسی و مطالعه نمود.

هر از چند گاهی با جایگزین تلسکوپ وضعیت حلقه روشن را امتحان نمائید.

آزمایش با عدسی mm 2 امیرسیون روغنی: فوکوس سیستم را چرخانده به گونه‌ای که بوضوح بتوان اسلاید و عدسی شیئی را مشاهده نمود.

دیافراگم را برداشته و سپس یک قطره روغن روی لامل قرار دهید.

عدسی mm 2 ایمرسیون روغنی را به محل خود منتقل نموده و سپس فوکوس را حرکت داده به گونه‌ای که بین عدسی شیئی و روغن تماس برقرار شود.

مراحل 14 تا 11 را با استفاده از دیافراگم مناسب عدسی مورد استفاده تکرار نمائید.

بعضی موارد کاربرد میکروسکوپ فاز - کنتراست میکروسکوپ فاز کنتراست وسیله ارزنده‌ای در بعضی مطالعات میکروسکوپی می‌باشد که این روزها بطور روزمره استفاده می‌شود.

این میکروسکوپ در مطالعات سلولهای زنده و تک سلولیها بسیار مفید است.

علاوه بر کاربرد در مطالعه تک سلولیها (protozoology) ، باکتریولوژی ، سیتولوژی و هیستولوژی در مطالعات صنعتی چون پلاستیکها ، فیبرها و کریستالها نیز مفید است.

نمونه مورد مطالعه بایستی تا حد ممکن نازک و یکنواخت باشد.

نمونه‌های ضخیم موجب خراب شدن تصویر می‌شود چون که لایه‌های مختلف دارای فوکوسهای متفاوت می‌باشند.

میکروسکوپهای پلاریزان دید کلی در بسیاری از مطالعات میکروسکوپی مثل مطالعه سنگها ، مواد شیمیایی کریستالی و بسیاری از ترکیبات آلی مثل ساختمان کراتین ، عضلات ، کلاژنها نیاز به استفاده از میکروسکوپهای پلاریزان می‌باشد.

جز اینها در مطالعات میکروسکوپی پلاریزان نور پلاریزه می‌باشد.

نور پلاریزه نور معمولی متشکل از فوتونها هستند دارای بردارهای الکتریکی و مغناطیسی عمود بر هم می‌باشند.

این دو میدان بطور سینوسی در حال نوسان می‌باشند و در ضمن در جهت عمود بر صفحه دو میدان و یا صفحه ارتعاشات این دو منتشر می‌شوند.

ارتعاشات میدان الکتریکی نور غیر پلاریزه در یک نقطه در همه جهات می‌باشد.

اکثر مواد شیشه‌ای و بسیاری از مواد دارای این ویژگی هستند که وقتی یک دسته پرتو نوری به آنها وارد شود در آن صورت سرعت انتشار و نحوه انتشار نور در جهات مختلف در آنها مشابه و یکسان می‌باشد و تنها تغییری که در نحوه حرکت دسته پرتو ضمن عبور از این مواد حاصل می‌شود آن است که بر اساس قوانین اسنل مسیر و جهت آنها نسبت به قبل از ورودشان به آن ماده تغییر می‌کند.

اینگونه مواد را مواد ایزوتروپیک (isotropic) می‌نامند.

مواد ایزوتروپیک در همه جهات دارای ضزیب شکست مشابه هستند.

بعضی مواد شفاف و نیمه شفاف دارای دو ضریب شکست می‌باشند، یعنی نحوه انتشار نور در داخل این مواد در جهات مختلف متفاوت است.

وقتی که یک دسته پرتو نوری به داخل این گونه مواد وارد می‌شود اگر نور غیر پلاریزه باشد در آنصورت به دو دسته پرتو تقسیم می‌شود.

این دو دسته پرتو در جهات عمود بر هم حرکت می‌کنند و ارتعاشات میدان الکتریکی آْنها کاملا بر هم عمود می‌باشد.

هر دسته پرتو بنام نور پلاریزه شده و صفحه ارتعاش آنها را صفحه پلاریزاسیون می‌نامند.

موادی که دارای این چنین خاصیتی هستند بنام مواد غیر ایزوتوپ می‌نامند.

بعضی مواقع نیز اینگونه مواد را مواد با ضریب شکست دو گانه می‌نامند.

در بررسیهای پلاریزاسیون لازم است که ما نور پلاریزه داشته باشیم این عمل را بوسیله یک صفحه پلاریزور می‌توان انجام داد.

نور خارج شده از صفحه پلاریزور یک نور پلاریز است.

میدان الکتریکی این فوتونها تنها در امتداد محور پلاریزاسیون صفحه پلاریزور ارتعاش می‌نماید.

روشهای تولید نور پلاریزه نور پلاریزه را می توان به طرق مختلف ایجاد نمود.

روشهاتی معمول عبارتند از: بازتابش شکست مضاعف جذب انتخابی پراکندگی در اینجا دو روش ایجاد نور پلاریزه مورد نیاز در میکروسکوپهای پلاریزان را مختصرا توضیح می‌دهیم: منشور نیکول این منشور از بلور کلسیت درست شده است (کلسیت یا کربنات کلسیم).

نور هنگام عبور از بلور کلسیت به دو دسته پرتو تجزیه می‌شود به گونه‌ای که اگر این بلور را مثلا بر روی نوشته‌ای قرار دهیم نوشته‌ها بصورت مضاعف دیده می‌شود.

نور وارد شده به کلسیت به دو دسته پرتو تجزیه می‌شود، که یکی تابع قوانین اسنل است که آنرا شعاع عادی می‌نامند.

دسته پرتو دیگر از قوانین نور عادی پیروی نمی‌کند لذا به آن پرتو غیر عادی گویند.

مسیر نور عادی و نور غیر عادی و همچنین سرعت انتشار این دو دسته پرتو با همدیگر متفاوت است، البته هر دو دسته پرتو نور پلاریزه می‌باشند.

منشور نیکول (Nicol) بدین گونه ساخته می‌شود که یک بلور کلسیت را در امتداد قطرش برش می‌دهند سپس قطعات بدست آمده را بوسیله صمغ مخصوصی بنام صمغ کانادا (Canada blasm) به همدیگر می‌چسبانند.

ضریب شکست این ماده 55/1 است که از ضریب شکست کلسیت برای شعاع عادی 656/1n= کمتر است و از ضریب شکست شعاع غیر عادی 482/1=n بیشتر می‌باشد.

لذا وقتی که نور به محل اتصال دو نیمه می‌رسد نور غیر عادی انعکاس کلی پیدا می‌کند و تنها نور عادی از آن خارج می‌شود و بنابراین نور خارج شده یک دسته پرتو پلاریزه شده می‌باشد.

می‌توان پلاریزه بودن نور خارج شده را بوسیله یک منشور دوم امتحان نمود.

در صورتی که دو منشور نیکل به موازات همدیگر قرار گیرند نور خارج شده از اولی بدون تغییر از دومی نیز خارج می‌شود و در صورتی که محور پلاریزاسیون آنها عمود بر هم قرار گیرند نور پلاریزه خارج شده از اولی از دومی عبور نمی‌نماید.

تورمالین نوع دیگری از پلاریزورها که بر اساس جذب انتخابی عمل می‌کنند موادی مثل تورمالین می‌باشند.

اینگونه مواد وقتی نور غیرپلاریزه به آنها بتاید پس از ورود مثل بلور کلسیت در آن شکست مضاعف اتفاق می‌افتد و لیکن شعاع عادی آن در صورت ضخامت کافی بلور کاملا در داخل بلور جذب می‌شود و شعاع غیر عادی از بلور خارج می‌شود.

بنابراین بلور تورمالین ارتعاشات را در یک راستا جذب و ارتعاشات در جهت عمود بر آن را عبور می‌دهد.

این خاصیت تورمالین مربوط به ساختمان ملکولی آن می‌باشد.

ماده تورمالین را نمی‌توان به جای منشور نیکول استفاده نمود، بخاطر آنکه این بلور رنگین است لذا نور سفید از آن عبور نمی‌کند.

آنالیزور (Analyser) آنالیزور یک پلاریزور دیگر است که نحوه کار آن دقیقا مشابه پلاریزر است بجز آنکه محل نصب آن در پشت پلاریزور واقع می‌باشد.

آنالیزور در میکروسکوپهای پلاریزان بین عدسی شیئی و چشم مشاهده کننده واقع است.

موقعی که در میکروسکوپها از منشور نیکول استفاده می‌شود.

معمولا آنرا درست بالای عدسی شیئی و یا درست بالای عدسی چشمی قرار می‌دهند تا از ایجاد مانع در مقابل نور جلوگیری نماید و لیکن در میکروسکوپهایی که از فیلترهای پلاروئید به عنوان آنالیزور استفاده می‌شود این فیلتر در داخل لوله عدسی نصب می‌گردد و دارای ورنیه می‌باشد که درصد چرخش آنرا می‌توان مشخص نمود.

عمدتا وقتی که نمونه‌ها را بوسیله نور پلاریزه مورد تابش قرار دهیم و مشاهده نمائیم تصویر مشابه حالتی است که از نور غیر پلاریزه استفاده می‌شود.

اما وقتی که در مقابل آن یک آنالیزور قرار دهیم در آنصورت مشاهده می‌شود که با چرخش آنالیزور در جهات مختلف روشنایی تصویر متفاوت خواهد بود.

در حالتی که محور پلاریزاسیون پلاریزور و آنالیزور بر همدیگر عمود باشند، در آن صورت نوری از آن به چشم مشاهده گر نمی‌رسد و در صورتی که دو محور به موازات هم باشند حداکثر نور خارج می‌شود.

در این صورت می‌توان تأثیر نمونه در چرخش نور را مشاهده و اندازه گیری نمود.

در حالتی که محور پلاریزاسیون پلاریزور و آنالیزور بر همدیگر عمود باشند کلیه نورهایی که مستیقما از پلاریزور به آنالیزور می‌رسند متوقف می‌شوند و از آن خارج نمی‌شوند و تنها آن بخش از نورهایی که بوسیله نمونه خارج و تغییر جهت داده می‌شود بوسیله آنالیزور عبور داده می‌شود و می‌توان بنابراین تأثیر نمونه را بر روی نور پلاریزه عبوری مطالعه نمود.

عدسیهای مختلفی که در ساختمان میکروسکوپهای پلاریزان مورد استفاده قرار می‌گیرد بایستی بدون هیچگونه رگه باشد و علاوه بر آن نبایستی خود دارای اثر پلاریزه کنندگی باشند.

در صورتی که از میکروسکوپهای معمولی بخواهیم برای بررسی خواص کندانسور استفاده نماییم باید آن را آزمایش نمود که این اشکالات در آنها وجود نداشته باشد.

وجود زاویه در هر یک از عدسیها خود می‌تواند موجب اثر پلاریزه کنندگی نور شود و بنابراین برای مطالعه نمونه‌هایی که خاصیت پلاریزه کنندگی آنها کم است بهتر است روزنه نور را تا حد ممکن کم نمود تا تأثیر زاویه دار بودن کمتر شود.

وسایل ملحقات یک میکروسکوپ پلاریزان با اضافه کردن وسایل لازمه به یک میکروسکوپ به گونه‌ای که بتوان در آن از نور پلاریزه استفاده نمود اطلاعات مفیدی از نمونه‌ها می‌توان بدست آورد.

در حالت بسیار ساده می‌توان با افزودن یک صفحه ساده پلاریزور و یک صفحه آنالیزر که بشود آنها را چرخاند می‌تواند این کار انجام شود.

لیکن در اندازه گیریهای دقیق و مواقعی که اندازه گیری مقداری مورد نیاز باشد بایستی از میکروسکوپ پلاریزان استفاده شود.

تجهیزات اضافی یک میکروسکوپ پلاریزان را می‌توان بطور مختصر بصورت زیر برشمرد: پلاریزور و آنالیزور که بتوانند به داخل و یا خارج محلهای مربوطه منتقل شوند و همچنین حول محور قائم بچرخند و در ضمن جهت آنها نیز نسبت به همدیگر قابل تعیین باشد.

خطوط متقاطع که بر روی چشمی نصب شوند بگونه‌ای که بتواند پس از نصب و تنظیم ثابت شوند و از چرخش آن جلوگیری نماید.

خارهایی که بتوان خطوط را بطور ثابت بطرف شمال – جنوب ، شرق – غرب یا در زاویه 45 درجه نسبت به این جهتها قرار دهد.

پایه نگه دارنده نمونه (machanical stage) که بتوان آنرا به تدریج بوسیله یک ورنیه چرخاند.

وسیله مناسب برای چرخاندن و یا انتقال پایه (stage) و هم محور کردن با محور اپتیکی.

شیارهایی در بدنه جهت وارد کردن جبران کننده.

جبران کننده‌ها در زیر پلاریزر در شکاف مخصوص خود قرار می‌گیرند.

این وسایل جهت جبران تأخیر فاز نمونه‌های بلورین ناشناخته بکار می‌روند.

یکم مرحله کندانسور در بالای پلاریزور یک عدسی برتراند و دیافراگم برزای امتحان و بررسی نوارهای تداخلی.

وسائل اضافی که جهت جبران تأخیر فاز بکار می‌روند عبارتند از: الف) گوه بسیار نازکی از کوارتز: این گوه به گونه‌ای بریده می‌شود که محور اپتیکی آن موازی خط الرأس گوه باشد.

معمولا این گوه را بر روی یک تیغه کوارتز به گونه‌ای می‌چسبانند که محور اپتیکی آن با محرو اپتیکی گوه عمود باشند.

در یک نقطه ضخامت گوه صفر است و لذا تأخیر فازی وجود ندارد و لیکن در نقاط دیگر بخاطر آنکه ضخامت صفر نیست تأخیر فاز وجود دارد.

در عمل موقع آزمایش بایستی محور اپتیکی نمونه و محور اپتیکی گوه بر هم عمود باشند به گونه‌ای که تأخیر فاز نمونه بوسیله گوه جبران شود.

این عمل موجب آن می‌شود که موقعی که آنالیزور و پلاریزور بر هم عمود عستند تاریک شوند.

در این حالت اختلاف فاز ایجاد شده بوسیله گوه درست برابر و در جهت خلاف نمونه می‌باشد از این طریق می‌توان اختلاف فاز نمونه را تعیین نمود.

ب) تیغه ربع موج: این تیغه دارای ضخامتی برابر با یک ربع طول موج می‌باشد.

بنابراین در اثر عبور نور از این تیغه فاز موج عقب خواهد افتاد.

این تیغه از جنس بلور میکا می‌باشد.

با استفاده از این تیغه و تغییر نقش تداخلی حاصل شده نوع بلور بدست می‌آید.

این تیغه همراه با تیغه ربع موج دیگری که در بالای پلاریزور قرار می‌گیرد بکار می‌رود.

ج) تیغه حساس به رنگ نور: این تیغه از تیغه نازک کوارتز درست شده است و دارای سطح صاف می‌باشد.

ضخامت تیغه معادل با تمام موج می‌باشد.

این بلور را بین دو لامل می‌چسبانند.

ویژگی این تیغه آن است که تأخیر فازهای کوچک حاصله شده در اثر نور عبوری از نمونه را به تغییرات رنگی که چشم حساس به آن است تبدیل می‌نماید.

تغییر رنگ حاصله معرف نمونه می‌باشد.

این تیغه برای رنگ سبز تمام موج می‌باشد یعنی تأخیر فازی حاصل نمی‌شود.

برای نور قرمز اندکی تأخیر فاز و برای نور آبی تأخیر فاز بیشتر ایجاد خواهد نمود.

تأخیر کوچک در تغییر فاز موجب تغییر سریع رنگ می‌شود.

د) پلاتین یونیورسال: معمولا محورهای اپتیکی نمونه‌های مورد مطالعه نسبت به سطح نمونه بصورت اتفاقی می‌باشند و لذا تنظیم مناسب موقعیت و زاویه آن نسبت به سطح افق جهت یافتن محورهای اپتیکی از طریق ایجاد و مشاهده نوارهای تداخلی بایستی بطور دقیق انجام شود.

برای این منظور از پلاتین یونیورسال استفاده می‌شود.

با استفاده از این وسیله می‌توان ضریب شکست را در جهات مختلف نمونه مربوط به پرتوهای عادی و غیر عادی تعیین نمود.

پلاتین یونیورسال بطور مناسب مدرج شده است به گونه‌ای که می‌توان جهت قرار گرفتن نمونه را از روی درجات مشخص نمود و از این طریق محورهای اپتیکی را تعیین نمود.

مشاهده بوسیله نور پلاریزه وضعیتهای مختلفی را که در مطالعه با میکروسکوپ پلاریزان می‌توان مشاهده نمود: وقتی که محور دو صفحه پلاریزور و آنالیزور موازی یا عمود بر یکدیگر می باشند.

وقتی که نور از چشمه خارج و به پلاریزور برخورد نماید نور خارج شده از آن نور پلاریزه و به موازات محور پلاریزاسیون پلاریزور می‌باشد.

در حالتی که آنالیزور به گونه‌ای باشد که محور پلاریزاسیون آن به موازات محور پلاریزاسیون صفحه پلاریزر باشد نور خارج شده از پلاریزور بدون تغییر از آن عبور نموده و به چشم می‌رسد.

در صورتی که دو صفحه محور پلاریزاسیونشان عمود بر همدیگر باشند نور خارج شده از پلاریزور نمی‌تواند از آنالیزور خارج و بوسیله آن جذب می‌شود، در آن صورت نوری به چشم نمی‌رسد.

وضعیت اولی وضعیت موازی دو صفحه پلاریزور و آنالیزور است و وضعیت دومی وضعیت متقاطع محورهای پلاریزاسیون دو صفحه پلاریزور و آنالیزور است.

این آزمایش را می‌توان در میکروسکوپ پلاریزاسیون با چزخش آنالیزور انجام داد.

در هر چرخش کامل 360 درجه‌ای دو مرتبه روشنایی ماکزیمم و دو مرتبه روشنایی مینیمم می‌شود.

در حالت زاویه 90 درجه نسبت به یکدیگر نور رسیده به چشم قطع می‌شود و در صفر درجه و 180 درجه روشنایی ماکزیمم می‌شود.

تشخیص فشار برای تشخیص تأثیر فشار همه عدسیهای میکروسکوپ را خارج نموده و دو صفحه پلاریزور و آنالیزور را با زاویه محرو پلاریزاسیون عمود بر هم قرار دهید.

یک صفحه اسلاید شیشه‌ای 1×3 اینج روی stage قرار داده به گونه‌ای که یک ضلع بزرگ اسلاید وقتی که داخل لوله نگاه می‌کنیم قابل دیدن باشد با نگه داشتن اسلاید بطور محکم بوسیله یک دست با دست دیگر دسته یک scalpel یا یک وسیله مشابه را با فشار روی لبه در حال مشاهده فشار دهید.

ناحیه روشن قابل مشاهده با اعمال فشار حذف می‌شود که نشان دهنده فشار الاستیک (elastic stress) می‌باشد.

بعد از آزاد شدن لبه از فشار مجددا لبه روشن قابل مشاهده است.

میکروسکوپ شناسها با همین روش ساده عدسیها را (polariscope) امتحان می‌نمایند.

هر نوع رگه (strain) بر روی عدسیها با این روش ساده قابل مشاهده است، چون که جهت نور را تغییر می‌دهد.

آزمایش پلیکریم (Test for pleochrosim) برای انجام این تست میکروسکوپ را تنظیم و با قرار دادن پلاریزور و آنالیزور در وضعیت داخل و خارج از موقعیت اصلیشان به ترتیب اینکار را انجام می‌دهیم.

با چرخاندن یک صفحه تورمالین که روی محل نمونه (stage) قرار دارد و توجه به تاریک و روشن شدن در وضعیتهای 90 درجه نسبت به همدیگر می‌توان مؤلفه‌های pleochroic را تشخیص داد.

تغییر رنگ و شدت ، ویژگیهای این پدیده است.

تست ایزوتروپیکی مواد با قرار دادن یک قطعه شیشه بدون رگه (unstrain) روی stage و چرخاندن آن بین دو صفحه پلاریزور و آنالیزور وقتی که زاویه بین محورهای پلاریزاسیون آنها 90 درجه است می‌توان ایزوتروپیک و غیر ایزوتروپیک بودن آنرا مشاهده نمود.

بایستی توجه داشت که در طول آزمایش پلاریزور و آنالیزور دارای زاویه 90 درجه می‌باشند.

در صورتی که ماده مورد آزمایش ایزوتروپیک باشد چون که ضریب شکست جسم ایزوتروپیک در همه جهات یکسان است لذا نمی‌تواند موجب تغییر روشنایی شود در غیر اینصورت روشنایی پس از آنالیزور تغییر می‌کند.

مواد بی رنگ غیر ایزوتروپ در نور تکرنگ یک صفحه سبز رنگ در جلو چشمه نور قرار داده و محورهای صفحات پلاریزور و آنالیزور را بطور عمودی نسبت به هم تنظیم و سپس نور پلاریزور را روی اسلاید حاوی نمونه با ضریب شکست دو گانه متمرکز نموده و سپس آزمایش را می‌توان انجام داد.

تهیه سمبل مناسب می‌تواند با قرار دادن دو قطره سولفات منیزیم غلیظ گرم (Espon salt) بر روی اسلاید عاری از چربی و سپس پوشاندن آن با یک پوشش شیشه‌ای باشد.

در این وضع در عرض چند دقیقه کریستال سوزنی شکل کوچکی رشد می‌نماید.

در صورتی که مایع باقیمانده را بوسله فیلتر کاغذی خارج نمائیم ادامه رشد کریستال متوقف می شود (برای بدست آوردن نمونه مناسب بایستی چندین نمونه تهیه نمود تا وضعیت و کریستال مطلوب بدست آید).

در صورتی که stage که حاوی کریستال است را بچرخانیم وضعیتهای تاریک و روشن را بطور متناوب خواهیم دید.

موقعیت تاریک بنام (extinction) موقعیت قطع خوانده می‌شود.

در صورتی که زاویه بین دو قطع را اندازه بگیریم زاویه آن 90 درجه بدست خواهد آمد.

موقعیت ماکزیمم روشنایی در زاویه 45 درجه ظاهر خواهد شد.

رفتار نمونه در بین دو صفحه پلاریزور و آنالیزور که بصورت عمودی نسبت به همدیگر قرار دارد مهمترین کاری است که بوسیله میکروسکوپ پلاریزان می‌توان انجام داد.

نوری که در راستای با ضریب شکست بیشتر از نمونه خارج می شود عقبتر است و یا بعد از نور در امتداد جهت یا ضریب شکست کمتر حرکت می‌نماید.

رابطه آنها نسبت به همدیگر در نقطه خروج تحت عنوان تأخیر نسبی (retardation) یا اختلاف فاز (phase difference) خوانده می‌شود.

تأخیر یا اختلاف فاز را می‌توان بر حسب طول موج بیان نمود (بر حسب میکرومتر).

مقدار تأخیر بستگی به دو فاکتور اختلاف بین ضریب شکستها در جهات مختلف و ضخامت نمونه دارد.

Birefringence یک ماده از کمیت مهم مواد می‌باشد که می‌توان آنرا با میکروسکوپ پلاریزان اندازه گیری نمود.

این کمیت برابر با اختلاف حداکثر و حداقل ضریب شکست آن ماده می‌باشد.

همچنین این کمیت ممکن است بر حسب تأخیر نسبی بر حسب میلیمتر تقسیم بر ضخامت نمونه بر حسب میلیمتر بیان شود.