دانلود مقاله گزینش و جداسازی سلول

پیشگفتار

این فصل دو مقوله: گزینش (Selection) و جداسازی(Isolation) سلول را در بر میگیرد. تقسیم بندی فوق از نظر اولویت صورت گرفته است. برای کسب بهینه ترین نتیجه، بهتر است که ایزولاسیون و گزینش به طور همزمان صورت گیرد. بغیر از سلول‏های سیستم خون سازی و بافت‏های جنینی خاص سلول‏های معمولی دیگر ذاتاً به ماتریس‏های خارج سلولی مرتبط می شوند. شیوه‏های متفاوت پاره کردن (گسیختن) ماتریس‏ها نه تنها بر کارائی گوراش آنزیمی بلکه بر جمعیت سلولی تأثیر می گذارد. همچنین سیستم کشت سلولی که شامل ماده بازال (بنیادی) و مکمل‏ها است نه تنها با فراهم کردن مواد غذایی و شرایط مناسب بر بقای سول‏ها تأثیر می گذارد بلکه می تواند یک پتانسیل گزینشی قابل ملاحظه را در ترجیح یک نوع سلول بر دیگری اعمال کند.

نوشته‏های فراوانی درمورد موضوعات این فصل وجود دارد. ایزولاسیون و پاک سازی سلول‏ها یک فرایند پیچیده است و یکی از اهداف این فصل کمک به آسان نمودن این پیچیدگی است. برای کسب اطلاعات مفصل در مورد جنبه‏های گوناگون کشت سلولی لطفاً به نوشته‏های فرشنی اشتودزینسکی و مسترز مراجعه کنید.

- ایزولاسیون سلول                                          CELL ISOLATION   

تحقیقات به خوبی نشان می دهد که انواع سلول‏های مشابه مانند سلول‏های فیبروبلاست، اندوتلیال یا پری ادیپوسایت‏ها در محل‏های آناتومی مختلف دارای مشخصه‏های متفاوت هستند. اما این موضوع که چگونه سلولهای آناتومی یک محل نیز مشخصه‏های متفاوت از خود نشان می دهند هنوز به خوبی شناخته شده نیست. ناهمگنی سلولی (هیتروژنیتی) در اثر خصوصیات ویژه آنها رخ می دهد. این خصوصیات می تواند یکی از پارامترهای عملیاتی جمعیت سلولی باشد. پدیده فوق با این تصور که خصیصه‏ها لزوماً در داخل جمعیت سلولی دارای توزیع همگن (هموژن) نیستند قابل توجیه است. فیبروبلاست‏ها جمعیتی هستند که در داخل محل آناتومی از خود خصوصیات فنوتیپیکی متفاوت نشان می دهند، مطالعات فرایز و همکارانش همچنین لکیک و همکارانش را بر روی موش، ریه انسان، لثه (پیرادندانی) و هتروژنیتی (ناهمگن) فیبروبلاست لثوی ملاحظه کنید. همچنین مشاهده شده است که فیبروبلاست‏ها عکس العمل‏های متفاوتی به تحریکات کلاژن‏های آزاد شده توسط تومور یا سلول‏های قلیا خواه (mast cells) نشان می دهند. علاوه بر این فنوتیپ‏های مختلف سلول‏های اندوتلیال عروق کوچک در کورپوس لوتئوم (جسم زرد گاو) (luteum bovine corpus) با در نظر گرفتن اکتین، سایتوکراتین و ویمنتین حساس به گاما، اینترفرون (IFN-) نشان دهنده هتروژینتی است. منطقی است اگر کل جمعیت سلولها را با توجه به خصیصه‏هایشان در هتروژنیتی (ناهمگن) دخیل بدانیم. هدف سنتی از انجام کشت سلول‏های اولیه تهیه مقدار کافی از سلول‏های قابل رشد واجد شرایط می باشد که تضمین کننده شباهت توزیع نهایی سلول‏ها با توزیع یافته شده در بافت اصلی است. استفاده از کشت سلولی به عنوان مدلی برای شرایط داخلی بدنی (in vivo) تا حد.ود زیادی به الزامات زیر نیازمند است. چندین فاکتور مؤثر بر نتیجه عبارتند از: محل آناتومی، پاتولوژی (آسیب شناسی)، نرمالسی (normalsy) یا درجه ایسکمی (کم خونی) میزان فراوانی بافت به کار رفته بر این فاکتور‏ها تأثیر می گذارد. طبیعت متنوع معماری بافت به روش‏های مختلفی برای توزیع سلول نیازمند است. برای مثال استخوان، مغز، ماهیچه‏های اسکلتی کبد و طحال دارای پیوندهای ماتریس سلول- سلول و سلول- برون سلولی هستند. نتیجه این شرایط این است که هیچ قراردادی همه انواع بافت را پوشش نمی دهد. در مورد نحوه ایجاد کشت اولیه و تجزیه بافت مطالب چندی منتشر شده است که تلاش در بهینه سازی این موضوعات برای سلول نتیجه بخش خواهد بود.

-توضیح

استراتژی‏های مختلفی برای ایزولاسیون سلول‏های موجود در بافت‏های سخت وجود دارد از جمله: روشهای برون کاشت (explantation) آنزیمی، مکانیکی و تجزیه شیمیایی، (chemical disaggregation) تزریقی (perfusion) یا ترکیبی از آنها. یکی از جدید ترین شیوه‏ها در جداسازی سلول و تکثیر سلول‏ها در داخل آزمایشگاه (in vitro) برون کاشت قطعه‏های بافت است. در این روش تا زمانی که انتشار مواد غذایی و گازها محدود نشود بافت به قطعات بسیار کوچک خرد میشود. این عمل با بریدن و کوچک سازی بافت مورد نظر تا اندازه ای مناسب صورت می گیرد. سپس قطعات باف در ظروف کشت بافت که با سرم جنینی گاو (fetal bovine serum) یا ماتریس‏های دیگر پوشیده شده است قرار داده می شود. ترکیب ماده و پوشش سطح همان طور که در ایزولاسیون انواع سلول از گلومرول‏ها (glomerulus) نشان داده شده است، می تواند اثر قابل توجهی بر نوع سلول نهایی تولید شده داشته باشد. همچنین می توان قطعات بافت را برای تثبیت اتصال در زیر پوشش قرار داد زیرا تماس مستقیم با سطح کشت بافت برای کشت موفق برون کاشتنی (explant) ضروری است.

عموماً برای قرار دادن بافت در محیط کشت از دستگاههای مکانیکی استفاده شده و هیچ گونه آنزیمی اضافه نمی گردد. کشت اولیه توسط روش برون کاشت نسبت به دیگر روشها زمان بیشتری را طلب می‌کند، اما روش برون کاشت به خاطر استفاده از خاصیت حساسیت پتانسیلی سلول مورد نظر به ترکیب آنزیم دارای مزایای بیشتری است. اگر آنزیم قابل ارائه در محیط باشد می توان بافت را با غلظت آنزیمی بهینه برای مدت کوتاهی در دمای اتاق و یا برای مدت طولانی تری در دمای c0 4 نگهداری کرد. در اینجا هدف، تجزیه بافت نیست بلکه سازگار کردن مناسب ماتریس برون سلولی جهت حرکت مؤثر سلول مورد نظر است.

دلیل انتخاب روش برون کاشت، حفظ سطح غشاء عملیاتی است. همچنین در مواردی که نمونه بافت موجود کوچک باشد روش جداسازی آنزیمی با مکانیکی بسیار مخرب بوده و سلول‏های فراوانی از دست می روند که ادامه کار را غیر ممکن می سازد. تأثیر آنزیم‏های پروتئولیتیک بر اجزا سطح سلول شناخته شده است، به طور مثال، ایموگلوبولین سطح (Ig) در اثر پروناز و کیموتریپسین به سرعت از لنفوسیت‏های B جدا شده ولی در اثر تریپسین و پاپائین این عمل کندتر انجام می شود و توسط کولاژن‏ها اصلاً صورت نمی گیرد. همچنین تریپسین در مقایسه با کلاژن فسفولیپیدها و اسیدهای چرب رادیواکتیو بیشتری را از غشاء اندوتلیال سلول آزاد می‌کند.

کشت اولیه برون کاشتی به قابلیت حرکت نوع سلول مورد نظر بستگی دارد از معایب این روش بالاتر بودن پتانسیل رشد انواع سلول آلاینده نسبت به سلول مورد نظر و مشکل پیوستگی قطعات بافت است. از طرف دیگر اگر سلول مورد نظر پر تحرک ترین سلول باشد این روش می تواند تکنیک منتخب باشد.

یکی دیگر از موارد مورد توجه از بین رفتن مشخصه‏های فنوتیپیک سلول‏های به واسطه گوارش آنزیمی است. اگر سلول‏ها دقیقاً بعد از جداسازی مورد استفاده قرار  گیرند، گوارش آنزیمی ضروری است. البته اگر هدف ایجاد یک جمعیت کشت سلولی آزمایشگاهی باشد شرایط اولیه سطح سلول از اهمیت کمتری برخوردار خواهد بود. ساختارهای  غشائی با پارامتر تحمل وارونگی توصیف شده و برای یک جمعیت سالم سلولی می توان فرض کرد که ساختارهای سطح قابل ترمیم خواهند بود.

البته این وضعیت برای هر نوع سلولی معتبر است.

- مکانیکی                                                                             MECHANICAL

روش‏های مکانیکی قطعه قطعه کردن بافت شامل روش گردابی، تکان دادن در شیکر چرخشی، پودر سازی با پیپت‏هایی با قطرهای متفاوت، عبور بافت از میان شبکه‏های نایلون و یا فولاد ضد زنگ و خرد کردن بافت با سوزن‏های نازک می شود. این فرایندها تعلیق سلول را زودتر از گوارش آنزیمی ایجاد می کنند، البته محدودیتهایی در این مورد وجود دارد. این روش‏ها به طور کلی برای همه بافتها مؤثر نیستند. تشخیص نوع روش بستگی به مقدار نیروی اعمال شده به بافت داشته که این جنبه می تواند سبب آسیب شود. سلول‏ها به برش حساس بوده و آسیب جدی می بینند. برش سلولهای استوبلاست شکل MC3T3-E1 به دست آمده از جمجمه نوزاد موش سبب تغییر مورفولوژی ‍(شکل) و کاهش تدریجی کلسیم بین سلولی باقی مانده گردید. همچنین رشد سلول‏های اندوتلیال به واسطه تنش برشی تیغه ای متوقف شد. ادامه این بحث در صفحات بعد آمده است. البته در مورد برخی از بافت‏های نرم از جمله طحال، تیموس، گره‏های لنفی کبد جنینی و تومورهای نرم و احتمالاً مغز می توان تجزیه مکانیکی را بدون آسیب سلولی اجرا کرد.

روش‏های مکانیکی در پاسخ به اثرات بالقوه زیان آور آنزیم‏ها درطول گوارش توسعه پیدا کردند. هنگامی که شرایط ایزولاسیون مناسب برای وسایل مکانیکی مهیا باشد این روش بر روش گوارش آنزیمی بخصوص بازسازی سلولی ارجعیت دارد. تحت این شرایط کاهش معرف‏هایی مانند آنزیم‏ها وجود منابع، تأثیرات و هر گونه مطلب قانون مند دیگر را غیر ضروری می سازد. البته زمانی که روش‏های مکانیکی با گوارش آنزیم همراه شود مؤثر تر خواهد بود. لایه لایه کردن بافت با چاقوی جراحی برای کم کردن اندازه بافت و در نتیجه افزایش سطح منجر به ایزولاسیون مؤثر تر می گردد.

-گوارش آنزیم                                                         ENZYME DIGESTION

نوع آنزیم به کار رفته بر نتیجه گوارش تحت عناوین بازده، راندمان محصول، قابلیت رشد و سمیت تأثیر می گذارد. ایزولاسیون سلول‏ها از تومورهای سخت با استفاده از تجزیه آنزیمی یا مکانیکی منجر به فراوانی‏های متفاوت می شود. در بافت ایزوله شده به روش آنزیمی، زیر جمعیت آنوپولید (aneuploid subpopulation) در مقایسه با بافت به دست آمده از تجزیه مکانیکی نمایان تر است. که بیانگر آسیب پذیری متفاوت جمعیت‏های مختلف سلول‏های بافت در برابر ترکیبات آنزیمی است. همچنین درمطالعات انجام شده بر فرایند جداسازی هپاتوسایت موش در هنگام استفاده از EDTA به جای کولاژن محتویات سایتوکروم 450 P قابل شناسائی به روش طیفی و مدت دار و حفظ و نگهداری سیستم اکسید از با کار کرد ترکیبی به دست آمد. در مورد این مشاهدات استثناهائی نیز وجود دارد: مطالعات نشان می دهد که سلول ‏های توموری را می توان با استفاده از گوارش آنزیم بسیار مؤثر تر از روش‏های مکانیکی جدا کرد . و اینکه کلاژن‏های ایزوله شده پیگ هپاتو سایت‏ها خیلی بیشتر از EDTA ایزوله شده هپاتوسایت‏ها زنده می مانند. یک تفسیر در مورد این نتایج متنوع بر مبنای حساسیت نسبی سلول‏ها نسبت به آنزیم‏ها و تجزیه مکانیکی استوار است. تأثیر بسیاری از متغیرهای غیر قابل کنترل نیز (به طور مثال شرایط بافت) بر این مشاهدات اضافه می شود.