دانلود مقاله برهم کنش های سلولی سطح مصنوعی بیومواد خود گرد آور(خود مجتمع)

پیشگفتار یکی از استراتژیهای مهندسی بافت استفاده از سلول های ایزوله شده است که درون ماتریس های سه بعدی رشد کرده و جایگزین ساختار و عملکرد بافت های صدمه دیده یا بیمار می شود.

از آنجا که سلول های دربرگیرنده بافت وابسته به بستر می‌باشند، تنها زمانی می توانند رشد و فعالیت کنند که به سطح مناسب چسبیده باشند.

برخی از متداول ترین مواد مصنوعی که به عنوان ماتریس در ترمیم و بازسازی بافت به کار رفته اند تخریب پذیر هستند مانند پلیمر های زیست سازگاری از قبیل پلی- ال- لاکتیک اسید پلی گلیکولیک اسید و کوپلیمرهای آنها.

خصوصیات مکانیکی نرخ های تخریب و ویژگی های متغیر سطح با کنترل پارامترهای ترکیب طول زنجیر و پردازش مواد قابل دستیابی است.

توانایی کنترل این خصوصیات جزء شرایط مهم مهندسی بافت است زیرا معمولاً اثرات متعاقب مانند چسبندگی رشد و عملکرد سلول را تعیین می کنند.

بررسی شیمی سطح نشان دهنده تاثیر آن بر چسبندگی انواع مختلف سلول های کشت شده (مانند سلول های فیبروبلاست واندوتلیال) است.

مطالعات نشان می دهد که شیمی سطح بر ترکیب، کمیت (اندازه) و ساختار پروتئین های جذب شده بر سطوح مواد اثر می گذارد.

تصور می شود که رونشینی نسبی سرم فیبرونکتین وویترو نکتین در پاسخ به شیمی سطح مسبب چسبندگی اولیه سلول به بستر است.

شیشه سیلانایز و تک لایه های خود مجتمع آلکانتیول ها به عنوان مدل های مطالعه بر هم کنش های خصوصیات بین سطحی مواد رونشینی پروتئین و عکس العمل های سلولی به کار برده می شوند.

متأسفانه این روش ها برای اصلاح سطوح داربست های مهندسی بافت مناسب نیستند.

بیومواد خود مجتمع که ساختارهای تیغه ای یا لایه ای را تشکیل می دهند اجازه کنترل دقیق خصوصیات سطح را داده و یکسان بودن مواد شیمیایی که به طور مکرر در طول زمان در نتیجه تخریب بستر آزاد می شوند را تضمین می کنند.

ملکول های سیستم مدل بررسی شده در اینجا حاوی یک بخش کلسترول و زنجیرهای کوتاه الیگو- ال- لاکتیک اسید هستند که در میان باند استری به طور کووالانت محدود شده اند (گیرافتاده اند).

دلیل انتخاب کلسترول به خاطر خصوصیات ترمو دینامیکی آن برای غشاء های سلول و قابلیت آن در تغییر انتقال (حرکت) غشاء و خصوصیات مکانیکی سلول است.

در حقیقت کلسترول یک جزء اصلی در غشاء سلول های یوکاریوتیک است که قابلیت جفت شدن با سلول ها در همه حالت به طرقی که بابر هم کنش های معمول دریافت کنند (رسپتور) لیگاند متفاوت است را دارد.

دلیل دیگر در انتخاب کلسترول، طبیعت مزوژنی (mesogonic) خوب آن است که به مشتقات آن اجازه تبدیل به حالت سیال بلورین را می دهد.

زنجیرهای الیگومری ال- لاکتیک اسید زیست تخریب پذیر بوده و قابلیت بر هم کنش با ماتریس های معمولی پلی- ال- لاکتیک اسید یا کوپلیمرهای مهندسی بافت را به وسیله بلورینه شدن مشترک (کوکریستالیزاسیون) یا باندهای ثانویه دارند.

در این حالت می توان ازساختارهای خود مجتمع جهت اصلاح سطوح داخلی داربست های سه بعدی ساخته شده از هومو پلیمرها یا کوپلیمرهای لاکتیک اسید و گلیکولیک اسید استفاده کرد.

در این فصل گزارشی از سنتز یکسری از بیومواد خود مجتمع به همراه ویژگی های مولکولی طراحی شده برای بر هم کنش با سلول ها و داربست های بازسازی بافت ارائه می شود.

بیومواد خود مجتمع را می توان به شکل محصولات مناسب با چند پراکنش پائین در حدود 15/1-05/1 سنتز کرد.

این مولکولها ساختارهای لایه ای را ایجاد می‌کند که تحت عنوان فازهای اسمکتیک (بلورینگی) بیان گردیده و قابلیت منظم شدن به شکل توده های تک بلورن با سلول واحد قائم الزاویه ای را دارند.

با قالب گیری بر بسترهای شیشه مشاهده می شود که ساختارهای لایه‏ای، گسترش و چسبندگی فیبروبلاست را افزایش داده و بدین ترتیب به شکل بسترهای زیست فعال رفتار می‌کند.

روش سنتز کردن مشتقات کولستریل- ال- لاکتیک اسید متنوع بوده و برای هر مولکول با عملکرد اسیدی صادق است (قابل استفاده است) نمونه هایی از مشتقات فعال شده عبارتند از مولکول هایی که دارای داروهای ضد تحریک با باندهای کووالانسی همانند اندومتاسین یا کروموفورزهایی مانند رودامین یا پیرین برای تصویر نگاری زیستی هستند.

این فصل همچنین فرایند استفاده از این بیومواد خود مجتمع در اصلاح سطوح داخلی داربست های پلی- ال- لاکتیک اسید که از طریق روش پالایش نمک پردازش می شود را بیان می‌کند.

این روش پوشش می بایست برای همه بیو مواد خود مجتمع کاربرد جامعی داشته باشد.

-مواد MATERIALS -سنتز کلستریل- (ال- لاکتیک اسید)n کلیه بندهای لیست ذیل دارای کیفیت تجاری بوده و از شرکت شیمیایی آلدریچ (میلواکی، ایالت ویسکانسین) به دست آمده اند مگر آنکه ذکر شود.

فلاسک ته گرد شیشه ای خشک شده در کوره تیغه (جدساز) لاستیکی و میله گردان (چرخان) کلسترول باز بلورینه شده از اتانول ال- لاکتید باز بلورینه شده از اتیل استات تری اتیلامین (TEA) نگهداری شده بر روی KOH دی کلرومتان () تازه تقطیر شده از 6-تلوئن تازه تقطیر شده از سدیم- بنزوفنون 7- ، - دی متیل فرمامید (DMF) نگهداری شده بر روی غربال های (صافی های)ملکولی 8-و قطع (II) ­(2- اتیل هگزا نوات) 9- متانول 10- حمام روغن از پیش گرم شده تا دمای و 11- صفحات (ورق) شیشه ای (مرک) mm25/0، با روکش ژل سیلیس 254F 12- ژل سیلیس مرک 60 (mm063/0-040/0، mesh 400-230 ، 60) -سنتز مشتقات کلستریل – (ال- لاکتیک- اسید)n کلستریل- (ال- لاکتیک اسید) n (دی متیل آمینو) پیریدینیوم- 4- تولوئن سولفونات (DPTS) تهیه شده بر طبق دستور فرآیند.

دی ایزوپروپیل کربودیمید (DIPK) 1-(3-دی متیل آمینو پروپیل)- 3- اتیل کربودیمید HCl (EDC) و 4- دیل متیل آمینو پریدین (DMAP) محلول آب نمک و مولکول های زیست عملیاتی: اندومتاسین، رودامین B، 1- پیرنبوتیریک اسید و کلستریل کلروفرمات 4- (ترت- بوتوکسی) بنزوئیک اسید، 4- آمینو بنزوئیک اسید و بنزیل- 4- هیدروکسی بنزوئات pd/C ، سلیت، TEA و محلول -تهیه سطوح شیشه آب خالص شده از طریق عبور از میان سیستم پالایش میلی- کیو‌(مقاومت cm M 2/18) اسید سولفوریک تلغیظ شده و اسید هیدروکلریک تغلیظ شده محلول هیدروکسید آمونیوم تغلیظ شده و 30% هیدروژن پراکسید (حجم 1: 4) تهیه شده در زمان آزمایش درپوش های شیشه ای (به قطر mm22) متناسب با 12 ورقه کشت بافت (کوستار) یا ظروف پتری شیشه ای به قطر cm7/2 باکف صاف (سفارشی) گاز نیتروژن صاف شده با فیلترهای (صافی های) nm22/0 (میلی پور) صافی های حلال سازگار 22/0 (آل تک، دیرفیلد، IL (ایالت ایلینوی) -تولید داربست پلی ال- لاکتیک- اسید، (چند شیوه ای (پلی سانیس) کلروفرم، کلرید سدیم‌ (فیشرساینتفیک، پترزبورگ، پنسیلوانیا) ظروف پیرکس پتری با درپوش های با اندازه mm150-50 (فیشر ساینتفیک) غربال های استاندارد آزمایش در اندازه 500-125 (فیشر ساینتفیک ) منگنه (پانچ) های فولادی استوانه ای (جنرال تولز) پارچه استریل تکز-وایپ (تگز- وایپ) -پوشش دهی داربست روش روکش دهی الف- صافی سلولی 40 (فالکون) ب- ظروف پتری شیشه ای mm50 (فیشرساینتفیک، پترزبورگ، پنسیلوانیا) ج- تایمر (زمان سنج) د- تترا هیدروفوران (فیشر ساینتفیک) -روش ثقلی الف- شبکه نایلونی 40 (فالکون) ب- نگهدارنده داربست: میله چرخشی شیشه ای 40/24 (ایس گلاس) ج- لوله تغذیه (خوراننده): چگالر فروکشنده (reflux Condenser) با یک جا انداز ویگرویکس (سفارش) که به به هم زدن گردش محلول در لوله کمک کرده و پوشش همگن سطح داربست را بهبود می بخشد.

د- منبع ذخیره محلول: قیف جداساز ml25 با جا انداز 20/14 ه- تترا هیدرید فوران (فیشر ساینتفیک) هـ- تترا هیدرید فوران (فیشر ساینتفیک) -کشت سلول فیبروبلاست نوار سلول فیبروبلاست موش6 T3 (96-CCL، مجموعه کشت نوع آمریکایی راک ویل، MD) ماده فیبروبلاست: ماده ایگل اصلاح شده دولبکو (DMEM ، گلوکوز بالا، ال- گلوتامین، mg/l110 سدیم پیرووات، گیبکو- BRL، گراند ایسلند، نیویورک)، سرم جنینی گاو 10% (هی کلون ، لوگان، ایالت یوتا)، پنیسیلین – استر مایسین (گیبکو- BRL) ml/U100-ml/mg100 تریپسین (25/0%) و تریپان بلو (گلیبکو- BRL) هماسایتومتر -روش ها METHODS سنتز کلستریل- (ال-لاکتیک اسید)n کلید این واکنش ها تحت محیط نیتروژنی انجام می شود.

عمل بسپارس متناسب با طول زنجیر الیگو (ال- لاکتیک اسید) مورد نظر در محلول یا توده تولوئن صورت می گیرد.

-بسپارش محلول Solution polyuerization به عنوان یک مثال معمولی می توان سنتز یک الیگومر با طول نهایی 20 لاکتیک اسید را شرح داد.

همانطور که انتظار می رود برای یک بسپارش «پویا» می توان وزن مولکولی را با کنترل نسبت مولی ال-لاکتید به آغاز کننده کنترل کرده و الیگومرهایی با چند پراکندگی در حدود 1/1 به دست آورد..

این روش بخصوص در سنتز الیگومرهای کلستریل- (ال-لاکتید اسید)n با n بیشتر از 20 ناسب بوده و در اثر ته نشینی ترکیب واکنش در متانول اضافی به راحتی قابل ایزوله کردن (جداسازی) است.

به خاطر قابلیت حل شدگی بالای الیگومرهای با وزن مولکولی پائین تر در متانول، محصولات ایزوله شده در هنگام اعمال این روش برای تهیه الیگومرهای کلستریل- (ال- لاکتیک اسید) با n کمتر از 20 به سرعت کاهش می یابند.

بسپارش آغازین شامل شکل گیری آلومنیوم آلدگساید در اثر اضافه نمودن 1 میزان به 3 میزان کسترول است که در ابتدا تولید می شود.

به طور ویژه M 9/1 محلول تولوئن به ترکیب ال- لاکتید (g65/24 و mmol1/17) و کلسترول در تلوئن (ml120) اضافه می شود.

این ترکیب به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق هم زده می شود و سپس در حمام روغن از پیش گرم شده تا دمای قرار داده می شود.

بعد از 5 ساعت بسپارش توسط MeOH (ml5) سرد می شود.

ترکیب گرم واکنش در MeOH (ml1500) رسوب می‌کند.

مواد جامد پالایش شده (صاف شده) و در دمای اتاق توسط خلاء خشک می کنیم.

محصول خام را از یک ستون کوتاه (7/7 5: 100 ) می گذرانیم.

محصول نهایی: g8/16 (54%) -بسپارش توده Bulk Polyuenzation سنتز یک الیگومر با طول زنجیره نهایی 10 واحد اسید لاکتیک به عنوان مثال نمونه توضیح داده می شود.

الیگومرهای کلستریل- (ال-لاکتیک اسید)n با وزن مولکولی کمتر در دمای داخل توده با کاتالیزور قلع II) (2- اتیل هگزانوات) سنتز می شوند.

در زمان نبود الکل به عنوان تطبیق دهنده، کنترل دقیق وزن مولکولی فرایند ممکن نیست.

هر چند در هنگام استفاده از ترکیب تطبیق دهنده الکل با مقدار کاتالیزور الیگومرهایی با وزن مولکولی مشخص (مطابق نسبت مولی ال-لاکتید به آغازگر) قابل تهیه هستند.

انجام بسپارش در توده سبب تسهیل عملکرد شده و محصولات ایزوله شده این زنجیر های کوتاه الیگومری را شدیداً بهبود می بخشد.

با وجود اینکه بسپارش توده ال- لاکتید با کاتالیزور یک فرایند کاملاً «پویا» نیست اما وزن مولکولی آن با تغییر نسبت ال-لاکتید به کلسترول قابل تنظیم بوده و پس از اتمام کار الیگومرهایی با پراکندگی های نسبتاً کم (2/1 ~) به دست می آید.

1- ترکیب ال-لاکتید (g19/10 ، mmol71) و کلسترول (g44/5، mmol14) در یک حمام روغن از پیش گرم شده تا قرار داده شده و تا زمانی که محتویات کاملاً ذوب شوند هم زده می شود.

محلول به تولوئن ml 1 ، ml/ g37/0) اضافه می شود.

ترکیب حاصل از واکنش را به مدت 5 ساعت در دمای به هم می زنیم.

ترکیب واکنش را تا دمای اتاق سرد می کنیم.

ماده جامد باقیمانده را با MeOH (ml100) خرد می کنیم (پودر می کنیم).

مواد جامد را صاف کرده و در دمای اتاق توسط خلاء خشک می کنیم.

محصول نهایی: g82/7 (50%) -سنتز مشتقات کلستریل- (ال- لاکتیک اسید)n مشتقات کلستریل – (ال- لاکتیک اسید)n از طریق استر سازی مستقیم حد نهایی الکل ثانویه (ترکیبی) الیگومر با اسید کربوکسیلیک واحد عملیاتی به دست می آیند.

این ترکیبات در شکل 1-65 نشان داده شده اند.

در حالت کلسترول اندومتازین و پیرین، آنها را ابتدا به بخش پیوند دهنده جفت شده (متصل شده) تا اسیدهای اروماتیک جهت جفت سازی آسان الیگومر از طریق روش DIPC/DPTS شکل گیرند.

-کلستریل- (ال- لاکتیک اسید)n –4-(اندومتازین) بنزوئات به عنوان یک مثال نمونه، مشتق الیگومر کلستریل- (ال –لاکتیک- اسید)34 شرح داده می‏شود.

1-DIPC (ml11/0، mmol 70/0 ) به شکل قطره ای به محلول کلستریل- (ال-لاکتیک اسید)34 (g87/1 ، mmol66%)، (اندومتازین)-بنزوئیک اسید (g 38/0، mmol 80/0) و DPTD (ل20/0 ، mmol 68/0) در (ml10)، اضافه شود.

الف-سنتز 4- (اندومتازین) – بنزولیک اسید (I)- Pd-C (g47/0 ، ، wt 50%) را به محلول بنزیل-4-(اندومتازین)-بنزوئات (g21/1 و mmol 13/2 ) در ترکیب EtAC (ml80) EtOH (ml40) اضافه می کنیم.

(II) مخلوط حاصل را در طول شب تحت محیط خلاء به هم می زنیم.

(III) ترکیب حاصل از واکنش را از طریق مجرای کوچک سلیت صاف می کنیم.

تا خشک شدگی کامل عمل تبخیر را ادامه می دهیم.

ب) سنتز بنزیل-4-(اندومتازین) بنزوئات DIPC (ml 0/1 mmol 40/6) را به محلول اندومتازین (g 0/1،mmol 80/2) ، DPTS (g24/1، mmol21/4) و بنزیل-4-هیدروکسی بنزوئات (g77/0، mmol37/3) پیش در DMF (ml30) اضافه می کنیم.

مخلوط حاصل را در طول شب تحت دمای اتاق به هم می زنیم.

ترکیب حاصل از واکنش را درون آب می ریزیم.

عصاره ترکیب سیال فوق را با (3*) می گیریم.

عصاره را با آب (1*) و آب نمک (1*) می شوییم.

فاز ‎آلی (ارگانیک) را جدا کرده و به وسیله خشک می کنیم.

تا خشک شدگی کامل عمل صاف کردن و تبخیر را ادامه می دهیم.

باقیمانده روغنی را با MeOH خرد می کنم، (پودر می کنیم).

مواد جامد را صاف کرده و از طریق خلاء خشک می‏کنیم.

محصول نهایی: g24/1 (79/0) 2-در طول شب در دمای اتاق به هم می زنیم.

3- ترکیب حاصل از واکنش را تا زمان خشک شدن تبخیر می کنیم.

4-باقیمانده را در کمترین مقدار دوباره حل کرده و در MeOH ته نشین می کنیم.

مواد جامد را صاف کرده و توسط خلاء خشک می کنیم.

محصول نهایی: g90/1 (88%) -کلستریل (ال- لاکتیک اسید)n-4-(کلسترول کربامیت) بزوئات مشتق الیگومر کلسترول- (ال-لاکتیک اسید)34 به عنوان یک مثال نمونه شرح داده می‏شود.

DIPC (20، mmol13/0) را به صورت قطره ای به محلول کلستریل-(ال- لاکتیک اسید)34 (g215/0 mmol076/0) اسید بنزوئیک-4- کلستریل کربامیت (g051/0، mmol23/2) در (Ml20) اضافه می کنیم.

سنتز بنزوئیک اسید – 4 کلستریل کربامیت: الف- محلول کلستریل کلروفرمات ) 0/1 ، mmol23/2) در (10ml) را به ترکیب 4- اسید آمینو بنزوئیک (g306/0،)mmo23/2) و تری اتیل آمین (ml31/0، mmol 23/2) در (ml20) اضافه می‏کنیم.

ب- TEA (ml31/0، mmol23/2) را به صورت قطره ای به ترکیب واکنش اضافه نموده و در طول شب در دمای اتاق به هم می زنیم.

ج- ترکیب حاصل از واکنش را با محلول آبکی (1*) آب (1*) و آب نمک (1*) می شویم.

د- فاز آلی (ارگانیک) را جدا کرده و بر روی خشک و صاف کرده و تا خشک شدن کامل تبخیر می کنیم.

هـ- باقیمانده را با خرد می کنیم.

(پودر می کنیم).

و- مواد جامد به دست آمده را صاف کرده و از طریق خلاء خشک می کنیم.

محصول نهائی: g92/0 (74%) 2- در طول شب در دمای اتاق به هم می زنیم.

3- ترکیب حاصل از واکنش را تا خشک شدن تبخیر می کنیم.

4- باقیمانده را در حداقل مقدار حل کرده و در MeOH رسوب می دهیم (ته نشین می کنیم).

ماده جامد را صاف نموده و از طریق خلاء خشک می کنیم محصول نهایی: g21/0 (83%) -کلستریل (ال- لاکتیک اسید)n اندومتاسیون مشتق الیگومر کلستریل (ال-لاکتیک اسید)25 با داروی ضد حساسیت (تحریک) اندومتاسین به عنوان یک مثال نمونه شرح داده می شود.

EDC (g096/0، mmol50/0) را به یک محلول یخ زده (سرد شده در یخ) کلستریل- (ال- لاکتیک اسید)25 (g507/0، mmol23/0)، اندومتاسین (g162/0 ، mmol45/0) و DMAP (g038/0، mmol31/0) در (ml60) اضافه می کنیم.

ترکیب را در طول شب در حمام یخ به هم می زنیم.

ترکیب حاصل از واکنش را تا خشک شدن تبخیر می کنیم.

باقیمانده را در (ml5) حل کرده و در MeOH (ml100) ته نشین می کنیم.

ماده جامد صاف شده را توسط خلاء خشک می کنیم.

محصول نهائی: g49/0 (84%) -کلستریل – (ال- لاکتیک اسید)n رودامین B مشتق الیگومر کلستریل- (ال- لاکتیک اسید)25 با رودامین B به عنوان یک مثال نمونه شرح داده می شود.

EDC (g096/0 ، mmol 50/0) را به محلول سرد شده در یخ کلستریل- (ال- لاکتیک اسید)25 (g52/0، mmol24/0) رودامین B (g21/0، mmol44/0) و DMAP(g035/0، mmol29/0) در (ml60) اضافه می کنیم.

مخلوط را در طول شب در حمام یخ هم می زنیم.

ترکیب حاصل از واکنش را تا زمان خشک شدن تبخیر می کنیم.

ماده جامد را صاف کرده و توسط خلاء خشک می کنیم.

با استفاده از کروماتوگرافی ستونی (V/V 10: 100 ) پالایش می کنیم.

محصول نهائی i: g050/0 فاز MeOH را تبخیر کرده و توسط کروماتوگرافی ستونی (V/V10: 100 ) پالایش می کنیم تا محصول گروه دوم به دست آید.

محصول نهائی ii : g 060/0 کلستریل- (ال- لاکتیک اسید)n –4-(1-پیرن کربوکسی لات) بنزوئات عملکرد پایانی الیگومر کلستریل- (ال-لاکتیک اسید)25-4-هیدورکسی بنزوئات با پیرین به عنوان مثال نمونه توضیح داده می شود.

DIPC (ml50، mmol32/0) را به صورت قطره ای به ترکیب کلستریل- (ال-لاکتیک اسید)25-4-هیدروکسی بنزوئات (g103/0، mmol045/0)، 1- اسید پیرن بوتیریک (g 025/0، mmol10/0) و DPTS (g047/0، mmol16/0) در (ml15)اضافه می کنیم.

سنتز کلستریل- (ال-لاکتیک اسید)25-4-هیدروکسی بنزوئات: الف- DIPC(ml70/0 ، mmol47/4) را به صورت قطره ای به ترکیب کلستریل – (ال- لاکتیک اسید)25 (g0/1، mmol53/0)، 4-(ترت بوتوکسی)- بنزوئیک اسید (g5/0، mmol63/2) و DPTS(g88/0، mmol 99/2) در (ml60) اضافه می کنیم.

ب- ترکیب حاصل از واکنش را در دمای اتاق در طول شب هم می زنیم.

ج- ترکیب حاصل از واکنش را تا زمان خشک شدن تبخیر می کنیم.

د-باقیمانده را در (ml20) دوباره حل کرده و در MeOH (ml400) ته نشین می کنیم.

هـ- مواد جامد را صاف کرده و توسط خلاء خشک می کنیم.

محصول نهائی :i g90/0 و- باقیمانده را در (ml80) دوباره حل کرده و در حمام یخ سرد می کنیم.

ز- ml15 ، ‏TFA را به صورت قطره ای اضافه نموده و برای یک ساعت در یخ هم می‏زنیم .

عمل هم زدن را در دمای اتاق به مدت یک ساعت دیگر ادامه می دهیم.

ح- ترکیب حاصل از واکنش را تا زمان خشک شدن تبخیر می کنیم.

ط- باقیمانده را در (10ml) دوباره حل کرده و در MeOHd (ml200) ته نشین می کنیم.

ی- مواد جامد را صاف کرده و توسط خلاء خشک می کنیم.

محصول نهایی ii : g74/0 در دمای اتاق در طول شب به هم می زنیم.

محصول خام به دست آمده را توسط کروماتوگرافی ستونی (7/7 5/2 : 100 MeOH-، ) پالایش می کنیم.

محصول نهائی g075/0 (66/0) -پاک کردن لام های (اسلایدهای) شیشه ای CLEANING OF GLASS SLIDES در پوش ها (که در رک درپوش شیشه ای سفارشی قرار می گیرند) یا ظروف پتری را در حمام گاز داغ اسید سولفوریک به مدت 10 دقیقه غوطه ور می سازیم.

درپوش ها را در آب خالص کاملاً شستشو می دهیم.

درپوش ها را به مدت 10 دقیقه در ترکیب گرم () هیدروکسید آمونیوم و پروکسید هیدروژن (با نسبت حجمی 1: 4) قرار می دهیم.

درپوش ها را کاملاً با آب خالص شستشو می دهیم.

درپوش ها را در محلول HCl در دمای اتاق قرار می دهیم.

درپوش ها را با آب خالص کاملاً شستشو می دهیم.

درپوش ها را با گاز نتروژن تصفیه شده خشک می کنیم.

اتوکلا و می کنیم.

روش تهیه فیلم برای مطالعات سلولی PERPARTION OF FILM FOR CELL STUDIES روش های زیر شیوه تهیه فیلم های نرم (صاف) مولکول های زیست فعال با ضخامت حدود را که قبلاً توصیف شده اند بیان می‌کند.

کلیه شرایط سترون کردن در دمای اتاق انجام می گیرد.

مواد را در حل کرده تا محلول wt% 2 به دست آید.

سپس آن را از میان غشاء صافی (22/0) نوع میلی متخلخل سازگار با حلال عبور می دهیم.

قالب گیری محلول الف) با پیپت ml 2 محلول پلیمر را در هر کدام از ظروف پتری با قطر cm7/2 قرار می دهیم.

ب) از پخش شدن محلول درکل سطح ظرف اطمینان حاصل می کنیم.

ج) هر ظرف را با ظرف پتری شیشه ای بزرگتری پوشانده و در یک هواکش شیمیایی به آرامی خشک می کنیم تا شکل گیری سطح هموار و صاف سریعتر انجام گیرد.

3-چرخش- پوشش الف) یک درپوش تیز را بر روی گیره (ماشین) خلاء پوشش دهنده چرخشی (دوار) سوار می کنیم.

ب) به اندازه کافی محلول را توسط پیپت جهت پوشاندن کل سطحذ بستر (در حدود ml5/0 برای درپوش) اندازه می گیریم.

(خارج می کنیم).

ج) فیلم ها را در دمای مناسب و مدت مشخص تحت خلاء گرم می کنیم تا شکل گیری نظم فاز بلورین مایع تسریع گردد.

-تهیه داربست SCAFFOLD PRODUCTION روش شرح داده شده فوق یک دیسک متخلخل پلی-ال-لاکتیک اسید (PLLA) mm50 را با قطر تقریبی mm1 تهیه کرده که می توان از آن متناسب با اندازه تقریباً 20-12 داربست مجزا به دست آورد.

این روش از طرف مایکوس و همکارانش پذیرفته شد.

در تولید داربست های بهینه در کاربردهای بعدی در کشت سلول می بایست از ابزارآلات تیز و استریل استفاده نمود.

g5/0 PLLA را در ml4 کلروفرم به مدت 60 دقیقه در ظرف شیشه ای حل می کنیم.

برای کمک به حل شدن میتوان محلول را برای 5 دقیقه سونی کیت کرد (تحت انرژی صوتی قرار داد).

نمک را تا حد اندزه مورد نظر غربال می کنیم.g4 نمک را در ظرف پتری mm50 قرار داده و به آرامی تکان می دهیم تا یک توزیع یکنواخت به دست آید.

کل محلول پلیمر را به نمک اضافه نموده و به آرامی به هم می زنیم تا توزیع یکنواختی به دست آید.

ظرف پتری را با درپوش خود و یک درپوش ثانویه دیگر می پوشانیم تا تبخیر حلال کند تر انجام گیرد.

ظرف را جهت خشک شدن بر روی سطح تراز یک هواکش شیمیایی به مدت 24 ساعت و به دنبال آن برای 24 ساعت تحت خلاء قرار می دهیم.

با استفاده از یک منگنه فولادی مدور، کامپوزیت های نمک پلیمر را به درون دیسک های کوچک (برای مثال با قطر mm 10) پانچ می کنیم.

داربست های مجزا را در یک ظرف پتری ml75 حاوی آب یون زدایی شده فوق خالص به مدت 48 ساعت قرار داده و هر 6 ساعت یک بار آب را عوض می کنیم.

برای ایجاد تکان های آرام (rpm40) می توان از میله هم زن تفلونی در محفظه پالایش استفاده نمود.

اسفنج های متخلخل پالایش شده را به مدت 24 ساعت تحت خلاء خشک می کنیم.

برای خارج سازی فیلم نازک پلیمر از کف هر داربست، یک نوار mm30 تکس- وایپ را به کلروفرم آغشته کرده و در اطراف ظرف پتری قرار می دهیم.

هر یک از داربست ها را به آرامی به مدت 3 ثانیه با نوار پارچه ای تماس داده و به سرعت خارج می کنیم.

کلیه نمونه ها را به مدت 8 ساعت تحت خلاء خشک می کنیم.

-پوشش دهی داربست SCAFFOLD COATING دو روش آسان در اینجا توضیح داده می شود.

اعمال روش پوشش دهی از طریق غوطه روی سازی بر روی داربست های حساس به آسانی قابل اجرا است.

از طریق روش غذارسانی گرانشی پوشش بهتری برای سطوح داخلی به دست می آید.

اما این شیوه می تواند سبب فروپاشی یا ترک خوردگی نمونه های شکننده که دارای یکپارچگی مکانیکی کمی هستند شود.

در موارد تخلخل بالا، روش غذاسازی گرانشی برای داربست های با خلل و فرج کوچک (250) مناسب است.

مثال حالت غذارسانی گرانشی در تصویر گسترده شکل 2-65 نشان داده شده است.

درکاربردهای معمولی قطعات بالا و پائین درهم فرو رفته و داربست را محکم در میان ظروف شیشه ای به دام می اندازند.

این حالت جریان سیال را به جای منحرف شدن در امتداد لبه ها در کل سطح مقطع دیسک داربست افزایش می‏دهد.

داربست ها به مدت 30 دقیقه قبل از پوشش دهی تحتUV سترون می شوند.

کلیه تجهیزات پوشش دهی باید اتوکلاوشده (یا از قبل سترون شده) و همه مواد شیمیایی باید قبل از استفاده فیلتر (صاف) شوند.

غلظت پلیمرها و زمان های پوشش دهی را می توان جهت اصلاح ضخامت پوشش تنظیم کرد.

روش پوشش دهی از طریق غوطه ورسازی الف) در یک ظرف شیشه ای (W/V) wt%1 مولکول پوشش را در ml10 تترا هیدروفوران حل می کنیم.

محلول پلیمر را به طور تقریباً کامل در یک ظرف کوچک پتری می ریزیم.

ب) داربست را در یک صافی نایلون سلولی قرار داده و کل مجموعه را در درون محلول غوطه ور می کنیم.

(3 ثانیه).

سپس صافی را خارج نموده و به داربست اجازه می دهیم قبل از غوطه وری مجدد اندکی خشک شود، (10 ثانیه) این کار را سه بار برای هر داربست تکرار کرده و به مدت 24 ساعت تحت خلاء بر روی ظرف شیشه ای خشک می کنیم.

ج- نمونه ها را تحت خلاء گرم کرده (بازپخت کرده) تا نظم لایه‏های سطحی خود مجتمع افزایش یابد.

صفحه مربوط به دماهای گذار، را مطالعه نمائید.

2-روش غذارسانی گرانشی الف- یک محلول پلیمر wt%1 در تترا هیدروفوران به شکل روش پوشش دهی از طریق غوطه ور سازی تهیه می کنیم.

هر داربست به ml5 محلول نیاز دارد.

ب- یک داربست منفرد را بین دو صفحه شبکه نایلونی قرار داده و نمونه لایه ای را در نگهدارنده داربست می گذاریم سپس لوله تغذیه را به نحوی جا می اندازیم که داربست نشان داده شده در شکل 2-65 را در میان گیرد.

ج- منبع محلول را با محلول پلیمر بارگیری کرده و به محلول اجازه می دهیم تا از میان داربست به طرف پائین جریان پیدا کند.

زمان شارش متناسب با اندازه خلل و فرج و تخلخل تغییر کرده که معمولاً بین 3 تا 30 ثانیه است.

د-لوله و داربست را با دقت خارج می کنیم.

داربست را بر روی ظرف شیشه ای در هوا خشک کرده و سپس به مدت 24 ساعت تحت خلاء قرار می دهیم.

هـ- نمونه ها را تحت خلاء گرم کرده (بازپخت کرده) تا نظم لایه های سطحی خود مجتمع افزایش یابند.

-کشت سلول فیبروبلاست بر روی فیلم های خود مجتمع بیومواد سلول های 6T3 را رشد داده تا در فلاسک های 75‏T در دمای 37 و محیط با رطوبت 10% جای گیرند.

اجازه عبور سلول‏ها را به وسیله شستن با PBS و نگهداری با ml2 تریپسین می دهیم.

سلول ها را توسط سانتریفوژ کردن جمع کرده و دوباره در محیط کشت معلق (رها) می سازیم.

فیبروبلاست ها را بر روی بستر های 1000 می افشانیم.

هر 2 روز یک بار محیط را تغییر می دهیم.