دانلود تحقیق تولید داربست های پلیمری انجماد - خشک سازی

داربست های پلیمری بکار رفته به عنوان جانشین برای ماتریس برون سلولی ارثی (ECM)، برای بازسازی استخوان، غضروف، کبد، پوست و بافت‏های دیگر استفاده می‌شود.

پلی لاکتید (PL)، پلی گلیکولید (PG) و کوپلیمرهای آنها (PLG) مواد مناسبی برای اعضاء جانشین به شمار می روند، زیرا در هنگام کاشت در اثر هیدرولیز بطور تصادفی تخریب شده و محصولات تخریبی آنها به شکل دی اکسید کربن و آب کلاً از بدن خارج می‌شود.

یک داربست ایده آل باید دارای تخلخل مناسب برای انتشار مواد غذایی بوده و امکان پاکسازی مواد زائد را داشته و دارای پایداری مکانیکی مناسبی جهت تثبیت و انتقال بار باشد.

علاوه بر این، شیمی سطح ماده باید چسبندگی سلول و علامت دهی داخل سلولی را به نحوی ارتقاء دهد که سلول ها فنوتیپ طبیعی خودشان را بروز دهند.

برای رشد سریع سلول، داربست باید همچنین دارای میکرو ساختار بهینه باشد (برای مثال، اندازه خلل و فرج، شکل، و مساحت ویژه سطح).

اثر اندازه خلل و فرج کاشتن بر بازسازی بافت توسط آزمایشاتی که نشان دهنده اندازه خلل و فرج بهینه برای فیبر وبلاست درون رست بین 20 و برای بازسازی پوست یک پستاندار بالغ و بسته به مکانیزم، برای بازسازی استخوان است، مشخص می‌شود.

بدین ترتیب، هدف اصلی در ساخت داربست ها برای بازسازی بافت، کنترل دقیق اندازه خلل و فرج و تخلخل است.

داربست های پلیمری زیست تخریب پذیر میکرو متخلخل توسط روش های متعددی که شامل قالب گیری حلال(solvent casting)- فرو شستن (پالایش)ذرات(particle leaching)، تفکیک فازیphase separation))، تبخیر حلال(solvent evaporation) و باند کردن فیبر(fiber bonding) برای شکل دهی شبکه پلیمر هستند، آماده می شوند.

این روشها به طور مفصل در فصل های دیگر آورده شده است.

در این فصل، قصد داریم یک شیوه پردازش جدید برای ساخت داربست‏های PLG بسیار متخلخل با مزایای اضافی که قابلیت تلفیق رشد پایه پروتئینی و فاکتورهای تفاضلی در زمان پردازش را دارند معرفی کنیم.

این شیوه خصوصاً ساخت دار بست هایی با تخلخل بیشتر از 90% و توانایی کنترل خلال و فرج هایی به اندازه 20 و را در بر می‏گیرد.

این روش پردازش شامل ایجاد یک امولسیون ازطریق هموژنیزه کردن (همگن سازی) محلول پلیمر – حلال و آب، سرد کردن سریع امولسیون جهت حفظ ساختارحالت مایع و حذف حلال و آب در اثر انجماد و خشک سازی است.

-موادMATERIALS پلی دی ال – لاکتید /گلیکولید (PLG) نرح مولی 15 : 85 ؛ پلیمرهای بیرمینگهام، بیرمینگام، AL (ایالت آلاباما) کلرید متیلین (Mc)، تشخیص باکستر(baxter diagnostics)، مک گراپارک، IL (ایالت ایلینوی) آب فوق خالص: درجه NaCl , Cacl2 و آلبومین سرم گاوی (BSA)، سیگما – آلدریچ، سنت لوئیس، MO (ایالت میسوری) پلی اتیلن گلیکول (PEG)، شرکت شیمیایی فلوکا، رونکونکوما، NY (نیویورک) -تجهیزاتEQUIPMENT هموژنایزر (همگن ساز)دستی، موسسه بین الملل امنی، واتربری (ایالت کنتیکت) تخلخل سنج جیوه ران (MIP)، تخلخل سنج اسکن خودکار 33، موسسه (شرکت) کوانتاکروم، سیوست، (نیویورک) NY وجود یک دستگاه انجماد – خشک ساز اصلاح شده ضروری است زیرا دستگاههای انجماد – خشک ساز تجاری قابلیت انجماد – حشک سازی MC یاحفظ دمش خلاء از بخارات MC را ندارند.

این سیستم از یک متراکم کننده (چگال ساز) (ویرتیس) -110c، متصل به یک تله نیتروژن مایع (ویرتیس، گاردینر، نیویورک)، متصل به یک پمپ خلاء مقاوم در برابر مواد شیمیایی (BOC , RV12) محصولات خلا (کششی) ادواردز، ویلمینگتون، ایالت ماساچوست) که قابلیت کشش خلاء به درون سیستم را تا حدود motorr 20 دارند، تشکیل شده است.

فرایند ساخت FABRICATION PROCESS نمودار فرآیند ساخت در شکل 1-60 نشان داده شده است.

در ابتدا دو محلول مخلوط نشدنی، فاز آلی و فاز آب را تشکیل می دهند.

فاز آلی توسط حل شدن PLG با ویسکوزیته ذاتی ویژه در MC چنان انجام می‌شود تا وزن در درصد حجم کل کل مطلوب امولسیون بدست آید.

فاکتورهای زیست فعال هیدروفوبیکو عوامل فعال در سطح را نیز می توان در این فاز جهت تلفیق و ارائه و کنترل میکرو ساختار داربست حل کرد.

فاز آب، از آب فوق خالص به همراه یا بدون افزودنی های حل شدنی مختلف مانند فاکتورهای زیست فعال هیدروفیلیک برای تلفیق و ارائه ایجاد می‌شود.

برای نمونه نمک های CaCl2 یا NaCl و یا عوامل فعال در سطح جهت کم به کنترل میکرو ساختار بکاربرده میشوند.

فازهای آب و آلی در یک لوله آزمایش شیشه ای که 40% حجم آن آب است، به هم اضافه شده و دو لایه نامخلوط را شکل میدهند.

بر اساس مطالعات اولیه، این درصد حجم آب پایدارترین وضخیم ترین امولسیون مناسب برای ساخت داربست‏ها را ایجاد می کند.ترکیبات دیگر منجر به ذوب شدگی و یا وارونگی فاز می شوند (به عبارت دیگر شکل گیری میکرو کره‏ها).

این لایه‏های نامخلوط به وسیله یک همگن ساز دستی که در سرعت های مختلف تنظیم میشود، همگن شده ودر یک قالب مناسب ریخته می‌شود (برای مثال، شیشه یا مس).

سپس با گذاشتن سریع قالب بر روی بلوک مس که در کنار نیتروژن مایع با دمای (~ -196c) قرار دارد سرد می‌شود.

سپس نمونه ها در یکدستگاه انجماد –خشک ساز سفارشی motorr20 و دمای آغازین -110C منجمد و خشک می شوند.

بعد از اینکه دمای داخل امولسیون برای یک ساعت در 110c- به تعادل رسید، دستگاه متراکم ساز خاموش شده و دستگاه متراکمساز و امولسیون به آرامی در طی 12 ساعت تا دمای اطاق گرم می شوند.

نمونه‏های بدست آمده در یک دستگاه خشک ساز خلاء در دمای اتاق برای ذخیره سازی وحذف بیشتر هر گونه حلال باقیماند قرارداده می شوند.

جهت کمینه سازی اتلاف پروتئین در طول فرایندساخت، یک شبکه نفوذی پلی اکریلامید –کوپلیمرشده با – اتیلن گلیکول، با یک همگن ساز وماده شیشه ای پیوند زده می‌شود تا رونشینی پروتئینadsorption)) از بین برود.

- تشریح (توصیف) داربست هاCHARACTERIZATION OF SCAFFOLDS میکرو ساختار داربست ها را می توان از نظر کیفی بوسیله میکروسکوپی اسکن الکترون ولتاژپایین (SEM)(1.3KV) و از نظر کمی توسط روش تخلخل سنجی جیوه ران (MIP) برای تعیین متوسط خلل و فرج و تخلخل که در جاهای دیگر نیز گفته شده است، تحلیل کرد.

بطور کلی، کلیه داربست های امولسیونی ساخته شده توسط روش انجماد – خشک سازی در محدوده درصد وزنی PLG که بطور خلاصه بیان شد و 40% حجمی آب، دارای تخلخلی بیشتر از 90% بوده و دارای مناطق سطح ویژه ای در حدود هستند.

این داربست ها دارای خلل و فرج های بسیار تو در تو با توزیع اندازه خلل و فرج بزرگ می باشند.

بزرگ ترین خلل و فرج ها، بیشتر از هستند.

البته، متوسط اندازه های خلل و فرج خاص با تغییر شرایط پردازش مشخص است.

داربست ها از طرفی که امولسیون بعد از متخلخل شدن در قالب، در معرض محیط قرار می گیرد، دارای پوسته غیر متخلخل هستند.

داربست های ضخیم، همگن،از نظر فیزیکی قابل کنترل، بدون حفره های فراوان (mm1> خلل و فرج‏های) به عنوان داربست های خوب شناخته می شوند متغیر های پردازش تاثیر گذار بر میکرو ساختارداربست PROCESSING VARIABLES AFFECTING SCAFFOLD MICROARCHITEVCTURE به غیر از درصد حجم درحجم آب، اثرات کلید متغیرهای دیگر نیزبرکیفیت فیزیکی ومیکرو ساختار داربست بررسی شدند.

بدلیل اینکه این فرآیند، متغیرهای فراوانی را در بر می گیرد، ارزیابی اثرات آنها با بکارگیری یک طرح آزمایشگاهی که تمامی فاکتورها را درنظر گیرد به تعداد آزمایشات تقریبا بی شماری نیازخواهد داشت.

برای مثال، در یک فرآیند 4 متغیره، هر کدام با 3 حالت ممکن، حداقل تعداد آزمایشات برای ارزیابی متغیرهای تاثیر گذار بر میکرو ساختار داربست برابر 81=34 خواهد بود.

برای کمینه کردن تعداد آزمایشاتی که به آرایه های عمودی طراحی شده آماری نیاز دارند، و برای تعیین مهم ترین متغیرهای کنترل، تحلیل آزمایشگاهی تاگوچی مورد استفاده قرار می گیرد.

متغیرهای مورد بررسی شامل، غلظت PLG وزن مولکولی PLG، سرعت همگن سازی، تثبیت کننده‏های امولسیون اضافی وعوامل فعال در سطح می شوند.

جدول 1-60 حاوی چکیده ای از اثرات این متغیرها بر میکروساختار و کیفیت فیزیکی داربست است.

-غلظت PLG PLG CONCENTRATION تاثیر سهم وزنی پلیمر (5 و w/v 10 پلیمر) بر میکروساختاروکیفیت فیزیکی داربست ارزیابی شده است.

غلظت های پلیمر بیشتر از w/v 10% برای ساخت داربست مناسب نیستند، زیرا ویسکوزیته بالای فاز آلی از همگن سازی مناسب جلوگیری میکند.

نمونه هایی با w/v 5% PLG، ذوب شدگی قابل ملاحظه ای را از خود نشان دادند که به میکروساختار آسیب وارد می کند، در حالیکه نمونه های با w/v 10% PLG دارای کیفیت فیزیکی بهتری بودند.

لذا w/v5% PLG به عنوان متغیر پردازشی زیست پذیر در نظرگرفته نمی شود.

ما همچنین مقدار میانی را با موفقیت آزمایش کردیم.

- وزن مولکولی PLG PLG MOLECULAR WEIGHT اثر ‍PLG، 57/0 و ارزیابی شد.

افزایش ‍PLG سبب بالا رفتن اندازه متوسط خلل و فرج و خصیصه های فیزیکی می‌شود.

اندازه متوسط خلل وفرج مستقیماً توسط ویسکوزیته محلول پلیمر تاثیر می پذیرد.بنابراین نمونه های با بالاتر، ویسکوزتر (لزج تر) هستند.

این مشاهدات می تواند بدلیل دو فاکتور ذیل باشد : بر طبق قانون استوک، افزایش نرخ خامه ای شدن را بوسیله افزایش چگالی محلول پلیمر وویسکوزیته امولسیون کاهش می دهد.

و بر طبق عبارت استوک – انیشتین برای ضریب انتشار، افزایش ویسکوزیته محلول پلیمر،نرخ کرکینه سازی(flocculation rate) را کاهش می دهد.

-سرعت همگن سازیHOMOGENIZING SPEED داربست های ساخته شده با سرعت های همگن سازی 5000 و rpm 17500 نشان می دهند که سرعت همگن سازی بالاتر منجر به بزرگ شدن اندازه متوسط خلل وفرج شده و خصوصیات فیزیکی را بهبود می بخشد.

این وضعیت دور از ذهن است زیرا تئوری بیان می کند که افزایش نرخ برش سبب کاهش اندازه کروی فاز آب و در نتیجه اندازه خلل و فرج می‌شود.

البته افزایش نرخ برش حبابهای هوا را در امولسیون القا کرده و بدین ترتیب سبب ایجاد داربست هایی با اندازه خلل و فرج های بزرگ می‌شود.

با وجود افزایش اندازه خلل و فرج، این روش پردازش متغیر بوده و کنترل آن دشوار است.در نرخ های برشی پایین تر، وجود حباب های هوا یک فاکتوربه حساب نمی آید.

تثبیت کننده ها وعوامل فعال در سطح امولسیون EMULSION STABILIZERS AND SURFACTANTS اثرات تثبیت کننده ها و عوامل فعال در سطح امولسیون و غلظت آنها برمیکرو معماری و کیفیت فیزیکی داربست بررسی شده اند.

تثبیت کننده های امولسیون و غلظت های تست شده آنها عبارت بودند از: این.

الکترولیت ها قبل از مرحله همگن سازی به فاز آب اضافه شدند.

بر اساس تئوری درجا گوئین لانداو – فروی – اوربک (DLVO) متوجه می شویم که وجود غلظت الکترولیت هایی مانند CaCl2 و NaCl می تواند پایداری امولسیون های روغن درآب را با تاثیر گذاری بر طول دبی بخاطر نیروی پس زنی الکتریکی بین ذرات تغییر دهد.با وجود اینکه تئوریDLVO ناشی از ذرات کلوئیدی دریک محیط قطبی (به عبارت دیگر، امولسیون روغن درآب) است و امولسیون بکار رفته در اینجا بر عکس است، اما این تئوری به همراه مفهوم افزایش نیروهای پس زنی و الکتریکی با حدود طولانی جهت افزایش پایداری امولسیون در این کار بکار گرفته می‌شود.

غلظت های مختلف الکترولیت برای فشرده سازی ذرات برای افزایش تخلخل نهایی و اجازه ندادن به ادغام شدن (یکپارچه شدن)همزمان ( به عبارت دیگر شکست امولسیون) انتخاب شده اند.

افزایش غلظت NaCl یا CaCl2 به پایداری سازی (تثبیت) امولسیون کمک کرده واجازه آرایش داربست های ضخیم با متوسط اندازه خلل و فرج کوچک تر را می دهد.

از آنجا که الکترولیت ها در فاز (ناپیوسته) آب هستند، NaCl یا CaCl2 ذرات سطح آب را باردار کرده و سبب افزایش نیروهای پس زنی الکترواستاتیک با حدود طولانی (بلند) در میان حلال MC غیر قطبی می شوند.

بدین ترتیب، بالا رفتن غلظت الکترولیت ظاهراً سبب افزایش نیروهای پس زنی الکترواستاتیک شده و با جلوگیری از تجمع و ادغام نهایی، طول دبی را نیز که به تثبیت ذرات کوچکتر در امولسیون کمک می کند، افزایش میدهد.

درمطالعات انجام شده بر روی دو عامل فعال در سطح BSA , PEG قبل از مرحله همگن سازی به فاز آب افزوده می شوند BSA , PEG به امولسیون اضافه می شوند تا به عنوان عامل فعال در سطح و تثبیت کننده فضایی عمل کرده تا از ادغام (یکپارچگی) ذرات متفرق شده جلوگیری کند.توجه داشته باشید که، عوامل فعال در سطح دیگر مانند پلوروئیک‏ها، اسپان و تویین نیز می توانند مورد استفاده قرار گرفته و متناسب باعامل فعال در سطح می توانند به فاز آب یا آلی اضافه شوند.

غلظت PEG در w/v 0.1% تثبیت می‌شود زیرا وارونگی فاز در غلظت های دیگر رخ می دهد و در عوض اثر وزن مولکولی، متوسط وزنی PEG ( Da 35000 یا 20000 Mw) بررسی شد.

غلظت PEG طوری انتخاب شد تا در محدوده غلظت بحرانی ریز واره(micelle) (cmc) باشد که در حدود M است .

cmc به عنوان غلظتی که در آن آرایش ریز واره بحرانی می‌شود تعریف گردیده و آن غلظتی است که در آن اثر عامل فعال در سطح قابل ملاحظه می‌شود.وزن های مولکولی متفاوت نیز می توانند مورد استفاده قرار گیرد.

البته باید توجه داشت که وزن ملکولی متوسط وزنی Mw بر cmc تاثیر می گذارد افزایش PEG Mw, سبب کاهش اندازه خلل و فرج می‌شود.

گرچه این عامل کم اهمیت ترین متغیر درمقایسه با فاکتورهای دیگر به حساب می آید، اما درکنترل کردن اندازه متوسط خلل و فرج اثر قابل ملاحظه ای دارد.

توجه کنید که هر چقدر Mw کوچکتر باشد تعداد مولکولهای PEG تا زمانی که مشابه به کار برده شود، بزرگتر می‏شود.

این افزایش Mw، cmc را کاهش داده و به همراه غلظت PEG بالاتر، cmc با سرعت بیشتری بدست آمده و خارج می‌شود.

بدین ترتیب برای افزایش پایداری امولسیون، cmc پایین تر از ارجحیت دارد، زیرا شکل گیری ریز واره‏ها بسیار سریعتر شده و ذرات کوچکتر اجازه شکل گیری دارند.

برای BSA، اثر غلظت (امولسیون 02/0 ، 01/0 ،2/0 ،5/0 ، 1 یا 2) ارزیابی شد، همچنین داربست های بار شده با 01/0 امولسیون و بدون هیچ گونه CaCl2 یا PEG ساخته شدند تا افزایش اثرات آنها بررسی شود.

غلظت BSA تا زمانی که از 2/0 امولسیون تجاوز نکند، بر اندازه متوسط خلل و فرج تاثیر قابل ملاحظه ای ندارد (شکل 2-60).

در غلظت های کمتر از 2/0 امولسیون، متوسط اندازه های خلل و فرج بین 55 و 70 بود.

غلظت های بین 2/0 و 1 امولسیون، BSA به عنوان یک عامل فعال در سطح و محافظت کلوئید عمل کرده تا اندازه ذرات متفرق فاز (آب) را کاهش دهد (به عبارت دیگر، متوسط اندازه خلل و فرج)؛ بدین ترتیب هر چقدر غلظت بالاتر باشد، متوسط اندازه خلل و فرج کوچک تر خواهد بود.

به نظر می رسد که در غلظت های بیشتر از 1 امولسیون، اثر عامل فعال در سطح به حد عملی رسیده باشد زیرا متوسط اندازه خلل و فرج در حدود 8/05/6 بدست آمد.

همه داربست ها دارای تخلخل و مساحت سطح ویژه بسیار بالا هستند ( به ترتیب 90% > و ) کنترل اندازه متوسط خلل و فرج از طریق تنظیم غلظت پروتئین به توانایی پروتئین‏ها در تاثیر گذاری بر تثبیت امولسیون‏ها بستگی دارد.

پروتئین ها در حد فاصل امولسیون ها رونشین و جمع شده و به عنوان عوامل فعال در سطح و محافظ کلوئید عمل می کنند.

واسطه امولسیون بکار رفته در این آزمایش شامل فاز هیدرو فوبیک (MC/PLG) است، آب زدایی لایه های هیدرو فوبیک از انرژی آزاد گیبز بین سطحی مطلوب پروتئین پیراگیر سطح هیدرو فوبیک می کاهید.

آلبومین با قابلیت تطبیق ساختاری بالا در تغییر شرایط محیطی، حتی اگر آب زدایی و یا بر هم کنش های دیگر نامطلوب باشند، تمایل به رونشینی در اغلب سطوح را دارد.

این کارآیی بیشتر توسط بار خالص منفی فراوان آلبومین ایجاد می‌شود که پایداری ساختار مولکول در در محلول کاهش داده و احتمال رونشینی آنی (خودجوش) را افزایش می دهد.

این رونشینی ترجیحی پروتئین (BSA) در حد فاصل، بر پایداری امولسیون و در نتیجه اندازه متوسط خلل و فرج داربست اثر می گذارد.

البته، با حذف CaCl2 و PEG، اثر عامل فعال در سطح BSA (01/0 امولسیون) تشدید شده و سبب کاهش شدید اندازه متوسط خلل و فرج از به می گردد (شکل 3-60).

تحلیل MIP توزیع اندازه خلل و فرج در شکل 4-60 نشان داده شده است.

همچنین، توزیع بزرگ اندازه خلل و فرج نیز با تمایز کامل در متوسط خلل و فرج بین گروههای 1 و 2 نماش داده شده است.

بدین ترتیب، اثرات CaCl2 و PEG به اثرات BSA اضافه نمی شود.

-روش ارحج ساخت داربست PREFERRED METHOD OF SCAFFOLD FACRICATION بر اساس اطلاعات ذکر شده که در جدول 1-60 خلاصه شده است، مجموعه ارجح شرایط ساخت داربست با کنترل اندازه خلل و فرج و کیفیت خوب فیزیکی به شرح زیر می باشد؛ غلظت PLG، سرعت همگن سازی .

داربست های ساخته شده بر اساس این پارامترها دارای کیفیت خوب فیزیکی و اندازه متوسط خلل و فرج هستند.

داربست هایی با کمترین اندازه متوسط خلل و فرج را می توان با افزودن غلظت های بالای BSA ( در 2 امولسیون) یا NaCl ( در M1) بدست آورد.

شرایط پردازش و اندازه متوسط خلل و فرج در جدول 2-60 خلاصه شده است.