دانلود تحقیق تولید داربست های پلیمری انجماد - خشک سازی

داربست های پلیمری بکار رفته به عنوان جانشین برای ماتریس برون سلولی ارثی (ECM)، برای بازسازی استخوان، غضروف، کبد، پوست و بافت‏های دیگر استفاده می‌شود. پلی لاکتید (PL)، پلی گلیکولید (PG) و کوپلیمرهای آنها (PLG) مواد مناسبی برای اعضاء جانشین به شمار می روند، زیرا در هنگام کاشت در اثر هیدرولیز بطور تصادفی تخریب شده و محصولات تخریبی آنها به شکل دی اکسید کربن و آب کلاً از بدن خارج می‌شود.

یک داربست ایده آل باید دارای تخلخل مناسب برای انتشار مواد غذایی بوده و امکان پاکسازی مواد زائد را داشته و دارای پایداری مکانیکی مناسبی جهت تثبیت و انتقال بار باشد. علاوه بر این، شیمی سطح ماده باید چسبندگی سلول و علامت دهی داخل سلولی را به نحوی ارتقاء دهد که سلول ها فنوتیپ طبیعی خودشان را بروز دهند. برای رشد سریع سلول، داربست باید همچنین دارای میکرو ساختار بهینه باشد (برای مثال، اندازه خلل و فرج، شکل، و مساحت ویژه سطح). اثر اندازه خلل و فرج کاشتن بر بازسازی بافت توسط آزمایشاتی که نشان دهنده اندازه خلل و فرج بهینه برای فیبر وبلاست درون رست بین 20 و  برای بازسازی پوست یک پستاندار بالغ و  بسته به مکانیزم، برای بازسازی استخوان است، مشخص می‌شود. بدین ترتیب، هدف اصلی در ساخت داربست ها برای بازسازی بافت، کنترل دقیق اندازه خلل و فرج و تخلخل است.

داربست های پلیمری زیست تخریب پذیر میکرو متخلخل توسط روش های متعددی که شامل قالب گیری حلال(solvent casting)- فرو شستن (پالایش)ذرات(particle leaching)، تفکیک فازیphase separation))، تبخیر حلال(solvent evaporation)  و باند کردن فیبر(fiber bonding) برای شکل دهی شبکه پلیمر هستند، آماده می شوند. این روشها به طور مفصل در فصل های دیگر آورده شده است. در این فصل، قصد داریم یک شیوه پردازش جدید برای ساخت داربست‏های PLG بسیار متخلخل با مزایای اضافی که قابلیت تلفیق رشد پایه پروتئینی و فاکتورهای تفاضلی در زمان پردازش را دارند معرفی کنیم. این شیوه خصوصاً ساخت دار بست هایی با تخلخل بیشتر از 90% و توانایی کنترل خلال و فرج هایی به اندازه 20 و  را در بر می‏گیرد.

این روش پردازش شامل ایجاد یک امولسیون ازطریق هموژنیزه کردن (همگن سازی) محلول پلیمر – حلال و آب، سرد کردن سریع امولسیون جهت حفظ ساختارحالت مایع و حذف حلال و آب در اثر انجماد و خشک سازی است.

-موادMATERIALS                                                                                              پلی دی ال – لاکتید /گلیکولید (PLG) نرح مولی 15 : 85 ؛ پلیمرهای بیرمینگهام،

بیرمینگام، AL (ایالت آلاباما)

کلرید متیلین (Mc)، تشخیص باکستر(baxter diagnostics)، مک گراپارک، IL (ایالت ایلینوی) آب فوق خالص: درجه  

NaCl , Cacl2  و آلبومین سرم گاوی (BSA)، سیگما – آلدریچ، سنت لوئیس، MO (ایالت میسوری) پلی اتیلن گلیکول (PEG)، شرکت شیمیایی فلوکا، رونکونکوما، NY (نیویورک)

-تجهیزاتEQUIPMENT                                                                                     هموژنایزر (همگن ساز)دستی، موسسه بین الملل امنی، واتربری (ایالت کنتیکت) تخلخل سنج جیوه ران (MIP)، تخلخل سنج اسکن خودکار 33، موسسه (شرکت) کوانتاکروم، سیوست، (نیویورک) NY

وجود یک دستگاه انجماد – خشک ساز اصلاح شده ضروری است زیرا دستگاههای انجماد – خشک ساز تجاری قابلیت انجماد – حشک سازی MC یاحفظ دمش خلاء از بخارات MC را ندارند.

این سیستم از یک متراکم کننده (چگال ساز) (ویرتیس)  -110c، متصل به یک تله نیتروژن مایع (ویرتیس، گاردینر، نیویورک)، متصل به یک پمپ خلاء مقاوم در برابر مواد شیمیایی (BOC , RV12) محصولات خلا (کششی) ادواردز، ویلمینگتون، ایالت ماساچوست) که قابلیت کشش خلاء به درون سیستم را تا حدود motorr 20 دارند، تشکیل شده است.

فرایند ساخت FABRICATION PROCESS                                                       

نمودار فرآیند ساخت در شکل 1-60 نشان داده شده است. در ابتدا دو محلول مخلوط نشدنی، فاز آلی و فاز آب را تشکیل می دهند. فاز آلی توسط حل شدن PLG با ویسکوزیته ذاتی ویژه  در MC چنان انجام می‌شود تا وزن در درصد حجم کل کل مطلوب امولسیون بدست آید. فاکتورهای زیست فعال هیدروفوبیکو عوامل فعال در سطح را نیز می توان در این فاز جهت تلفیق و ارائه و کنترل میکرو ساختار داربست حل کرد. فاز آب، از آب فوق خالص به همراه یا بدون افزودنی های حل شدنی مختلف مانند فاکتورهای زیست فعال هیدروفیلیک برای تلفیق و ارائه ایجاد می‌شود. برای نمونه نمک های CaCl2 یا NaCl و یا عوامل فعال در سطح جهت کم به کنترل میکرو ساختار بکاربرده میشوند. فازهای آب و آلی در یک لوله آزمایش شیشه ای که 40% حجم آن آب است، به هم اضافه شده و دو لایه نامخلوط را شکل میدهند. بر اساس مطالعات اولیه، این درصد حجم آب پایدارترین وضخیم ترین امولسیون مناسب برای ساخت داربست‏ها را ایجاد می کند.ترکیبات دیگر منجر به ذوب شدگی و یا وارونگی فاز می شوند (به عبارت دیگر شکل گیری میکرو کره‏ها). این لایه‏های نامخلوط به وسیله یک همگن ساز دستی که در سرعت های مختلف تنظیم میشود، همگن شده ودر یک قالب مناسب ریخته می‌شود (برای مثال، شیشه یا مس). سپس با گذاشتن سریع قالب بر روی بلوک مس که در کنار نیتروژن مایع با دمای (~ -196c) قرار دارد سرد می‌شود. سپس نمونه ها در یکدستگاه انجماد –خشک ساز سفارشی motorr20 و دمای آغازین -110C منجمد و خشک می شوند. بعد از اینکه دمای داخل امولسیون برای یک ساعت در 110c- به تعادل رسید، دستگاه متراکم ساز خاموش شده و دستگاه متراکمساز و امولسیون به آرامی در طی 12 ساعت تا دمای اطاق گرم می شوند. نمونه‏های بدست آمده در یک دستگاه خشک ساز خلاء در دمای اتاق برای ذخیره سازی وحذف بیشتر هر گونه حلال باقیماند قرارداده می شوند. جهت کمینه سازی اتلاف پروتئین در طول فرایندساخت، یک شبکه نفوذی پلی اکریلامید –کوپلیمرشده با – اتیلن گلیکول، با یک همگن ساز وماده شیشه ای پیوند زده می‌شود تا رونشینی پروتئینadsorption)) از بین برود.

- تشریح (توصیف) داربست هاCHARACTERIZATION OF SCAFFOLDS         میکرو ساختار داربست ها را می توان از نظر کیفی بوسیله میکروسکوپی اسکن الکترون ولتاژپایین (SEM)(1.3KV) و از نظر کمی توسط روش تخلخل سنجی جیوه ران (MIP) برای تعیین متوسط خلل و فرج و تخلخل که در جاهای دیگر نیز گفته شده است، تحلیل کرد. بطور کلی، کلیه داربست های امولسیونی ساخته شده توسط روش انجماد – خشک سازی در محدوده درصد وزنی PLG که بطور خلاصه بیان شد و 40% حجمی آب، دارای تخلخلی بیشتر از 90% بوده و دارای مناطق سطح ویژه ای در حدود  هستند. این داربست ها دارای خلل و فرج های بسیار تو در تو با توزیع اندازه خلل و فرج بزرگ می باشند. بزرگ ترین خلل و فرج ها، بیشتر از  هستند. البته، متوسط اندازه های خلل و فرج خاص با تغییر شرایط پردازش مشخص است.

داربست ها از طرفی که امولسیون بعد از متخلخل شدن در قالب، در معرض محیط قرار می گیرد، دارای پوسته غیر متخلخل هستند. داربست های ضخیم، همگن،از نظر فیزیکی قابل کنترل، بدون حفره های فراوان (mm1> خلل و فرج‏های) به عنوان داربست های خوب شناخته می شوند

متغیر های پردازش تاثیر گذار بر میکرو ساختارداربست

PROCESSING VARIABLES AFFECTING SCAFFOLD MICROARCHITEVCTURE

به غیر از درصد حجم درحجم آب، اثرات کلید متغیرهای دیگر نیزبرکیفیت فیزیکی ومیکرو ساختار داربست بررسی شدند. بدلیل اینکه این فرآیند، متغیرهای فراوانی را در بر می گیرد، ارزیابی اثرات آنها با بکارگیری یک طرح آزمایشگاهی که تمامی فاکتورها را درنظر گیرد به تعداد آزمایشات تقریبا بی شماری نیازخواهد داشت.

برای مثال، در یک فرآیند 4 متغیره، هر کدام با 3 حالت ممکن، حداقل تعداد آزمایشات برای ارزیابی متغیرهای تاثیر گذار بر میکرو ساختار داربست برابر 81=34  خواهد بود. برای کمینه کردن تعداد آزمایشاتی که به آرایه های عمودی طراحی شده آماری نیاز دارند، و برای تعیین مهم ترین متغیرهای کنترل، تحلیل آزمایشگاهی تاگوچی مورد استفاده قرار می گیرد. متغیرهای مورد بررسی شامل، غلظت PLG وزن مولکولی PLG، سرعت همگن سازی،  تثبیت کننده‏های امولسیون اضافی وعوامل فعال در سطح می شوند. جدول 1-60 حاوی چکیده ای از اثرات این متغیرها بر میکروساختار و کیفیت فیزیکی داربست است.

-غلظت PLG PLG CONCENTRATION                                                        تاثیر سهم وزنی پلیمر (5 و w/v 10 پلیمر) بر میکروساختاروکیفیت فیزیکی داربست ارزیابی شده است. غلظت های پلیمر بیشتر از w/v 10% برای ساخت داربست مناسب نیستند، زیرا ویسکوزیته بالای فاز آلی از همگن سازی مناسب جلوگیری میکند. نمونه هایی با w/v 5% PLG، ذوب شدگی قابل ملاحظه ای را از خود نشان دادند که به میکروساختار آسیب وارد می کند، در حالیکه نمونه های با w/v 10% PLG دارای کیفیت فیزیکی بهتری بودند. لذا w/v5% PLG به عنوان متغیر پردازشی زیست پذیر در نظرگرفته نمی شود. ما همچنین مقدار میانی  را با موفقیت آزمایش کردیم.

- وزن مولکولی PLG PLG MOLECULAR WEIGHT                                       اثر  ‍PLG، 57/0 و  ارزیابی شد. افزایش  ‍PLG سبب بالا رفتن اندازه متوسط خلل و فرج و خصیصه های فیزیکی می‌شود. اندازه متوسط خلل وفرج مستقیماً توسط ویسکوزیته محلول پلیمر تاثیر می پذیرد.بنابراین نمونه های با  بالاتر، ویسکوزتر (لزج تر) هستند. این مشاهدات می تواند بدلیل دو فاکتور ذیل باشد : بر طبق قانون استوک، افزایش  نرخ خامه ای شدن را بوسیله افزایش چگالی محلول پلیمر وویسکوزیته امولسیون کاهش می دهد. و بر طبق عبارت استوک – انیشتین برای ضریب انتشار، افزایش ویسکوزیته محلول پلیمر،نرخ کرکینه سازی(flocculation rate) را کاهش می دهد.