دانلود تحقیق تولید داربست های پلیمری پلیمریزاسیون (بسپارش)

پیشگفتار داربست های به دست آمده از طریق روش بسپارش کانیدهای خوبی برای مهندسی بافت به شمار رفته و به دلیل سهولت ساخت نسبت به روش دیگر ساخت داربست ارجحیت دارند.

با وجودیکه پلیمرهای مختلفی را می توان به این روش بسپارش کرد.

اما تعداد کمی از آنها منجر به داربست هایی با قابلیت دخول سلول یا همان داربست های متخلخل می شوند.

برای نمونه پلی اتیلن گلیکول- مالتی-اکریلیت و پلی 2- هیدروکسی اتیل متا اکریلات (PHEMA) می توانند به صورت شبکه ای یا به حالت اصلی بسپارش شوند، هر چند ساختار ایجاد شده به جای داربستی با خلل و فرج های بزرگ درهم برای نفوذپذیری سلول ها به شکل ژل می باشد.

با دستکاری (تغییر) شرایط بسپارش می توان داربست های متخلخل از PHEMA و پلی- ان- 2-هیدروکسی پروپیل متا اکریلامید (PHPMA) ایجاد کرد.

به طور خلاصه ترکیب منومری (تک پار) در حضور حلالی که منومر در آن قابل حل ولی پلیمر غیر قابل حل است، درون قالب بسپارش می شود.

گذار حلالیت درخلال بسپارش منجر به دو فاز می گردد، ساختار زیستی پیوسته پلیمر و حلال (شکل 1-63) بدین ترتیب، داربست تولید شده در نتیجه بسپارش برای ایجاد خلل و فرج های در هم نیازی به پالایش پروژن ندارد.

برای داربست های PHEMA با قابلیت دخول سلول که اغلب به نام اسفنج های PHEMA خوانده می شوند حلال مازاد معمولاً آب است.

اسفنج های PHEMA نخستین بار در سال 1960 ساخته شده و اولین کاربرد بالینی آنها افزایش حجم پستان و جایگزینی عضروف بینی بود.

اسفنج‏های PHEMA قابلیت تحمل اتوکلاو را داشته و به سادگی به اشکال مختلف تغییر فرم می دهند و به خاطر خصوصیات فیزیکی اسفنجی برای جراح مانند بافت نرم هستند.

برخی از محققین ، اسفنج های PHEMA را جایگزین بافت نرم با قابلیت کاربردی متنوع نامیده اند.

با این حال آهکی شدن آنها در محیط آزمایشگاه در مدت زمان طولانی سبب کند شدن سرعت توسعه اسفنج های PHEMA تا اوایل 1990 یعنی زمانی که چیریلا از اسفنج های PHEMA برای پروژه قرنیه مصنوعی استفاده کرد، شد.

اسفنج های PHEMA از آن موقع به بعد به عنوان حاشیه متخلخل قرنیه مصنوعی که باموفقیت های بالینی فراوانی مواجه شد توسعه یافتند.

داربست های PHEMA قابل نفوذ برای سلول ها بوده و به همین دلیل به عنوان یک قلاب (نگهدارنده) بین بافت قرنیه و هسته مرکزی شفاف غیرقابل نفوذ به کار برده می شود همچنین میتوان با تلفیق اسفنج های PHEMA با کاشتنی چشمی (اربیتال) سبب نفوذ ماهیچه ها به داخل اجزاء PHEMA شد.

تست های آزمایشگاهی و درون بدنی اسفنج های PHEMA لزوم نفوذ (هجوم) سلول را برای کاربردهای مهندسی بافت ثابت کرده اند.

اشکال مختلف داربست به واسطه پیامد بسپارش اجازه تغییر ساختار مصنوعی را در حین سنتز می دهد.

این فصل روش تحلیل ساخت اسفنجهای PHEMA قابل تولید در آزمایشگاههای تحقیقاتی را تشریح می‌کند.

معرف ها(شناسگرها)REAGENTS سیستم های آغاز کننده و منومر اسفنج های PHEMA گران نبوده و مواد شیمایی فوق آماده مصرف هستند.

مواد شیمیایی فهرست شده در جدول 1-63 و 2-63 از آلیدرچ (میلواکی ایالت ویسکانسین) قابل خریداری هستند.

آب به کار رفته معمولاً مقطر بوده و یون زدایی شده است و دارای مقاومت M18 می باشد، میلی پور میلی رو مثبت 10 و میلی- کیویواف مثبت (بدفورد، ایالت ماساچوست) -روش هاMETHODS مراحل کلیدی در سنتز اسفنج های PHEMA برای مقاصد پزشکی- زیستی عبارتند از: تهیه قالب تهیه فرمولاسیون اعمال- تزریق فرمولاسیون به قالب بسپارش و تشکیل داربست استخراج ساکس هلت (soxhlet) داربست استریلزاسیون (سترون کردن) نفوذ سلولی داربست پردازش ساختار بافت -تهیه قالبMOLD PREPARATION قالب ها باید قبل از تهیه فرمولاسیون بسپارش آماده باشند.

قالب باید هم در دسترس بوده (به عبارت دیگر شیشه یا پلی پروپیلن) و هم به طور کامل با الکل قابل پاک کردن باشند (به عبارت دیگر تفلون).

از آنجا که PHEMA به پلی استایرن فولاد و لوله تایگون می چسبد حفظ کیفیت سطوح در هنگام استفاده از این مواد به عنوان قالب مشکل است.

-تهیه فرمولاسیون FORMULATION PREPARATION تهیه ترکیب منومر ساده است: ابتدا همه سیالات فهرست شده در جدول 1-63 را به غیر از عامل شتاب دهنده ( - تترامتیل اتیلن دیامین، TEMED ) در ظرف شیشه ای به هم اضافه می کنیم.

ظرف را به مدت 3 دقیقه در حمام اولتراسونیک- قرار می دهیم و مراقب هستیم تا دمای حمام ثابت باقی بماند.

بعد از اضافه کردن عامل شتاب دهنده، ترکیب را برای 30 ثانیه به آرامی تکان داده یا می غلطانیم.

از حرکت شدید و تند خودداری می کنیم زیرا که ممکن است سبب ورود اکسیژن به داخل ترکیب شده و جنبش بسپارش را تغییر دهد.

فرمولاسیون فوق را می توان اکنون به داخل قالب تزریق کرد.

-اعمال-تزریق فرمولاسیون به قالب DISPENSING / INJECTION FORMULATION INTO MOLDS فرمولاسیون به دست آمده را میتوان با یک سرنگ یک بار مصرف با سوزن درجه 18 به قالب مورد نظر که دارای شکل و ابعاد مطلوب محصول نهایی است تزریق نمود.

جلوگری از ایجاد حباب در زمان تزریق فرمولاسیون از اهمیت ویژه ای برخوردار است.

فرمولاسیون باید قبل از رخ دادن تفکیک فاز (به عبارت دیگر سفید شدگی) تزریق شود.

-بسپارش و تشکیل داربست POLYMERIZATION AND FORMATION OF SCAFFOLD از آنجا که دما بر جنبش بسپارش تأثیر می گذارد حفظ دمای ثابت قالب در طول بسپارش ضروری است.

زمان بسپارش در حدود 10-2 ساعت در دمای اتاق بوده و به ترکیب دقیق فرمولاسیون بستگی دارد.

فرمولاسیون های حاوی آغاز کننده ها و یا عامل های شبکه ساز کمتر معمولاً به زمان بیشتری برای شکل گیری قالب نیاز دارد.

قالب ها معمولاً در طول شب باقی مانده و یا در فری با دمای C 0 50 به مدت 3 ساعت پس از سپری شدن 10-2 ساعت نخستین از تبدیل کامل و باقی ماندن کمترین میزان منومرها قرار داده می شود.

تفکیک فاز و ژل سازی دو تغیر فیزیکی هستند که در حین بسپارش قابل مشاهده هستند.

تفکیک فاز یا سفید شدگی فرمولاسیون را می توان با طیف سنجی در nm550 پس از 60-5 دقیقه (به عکس العمل کنتیک ها بستگی دارد) تشخیص داد.

استفاده از کووت های پلی استایرن یک بار مصرف برای سنجش نور بهترین انتخاب است چرا که پلیمر به سطوح کوارتز می چسبد.

بعد از تفکیک فاز، ترکیب در حالت سیال باقی مانده تا ذرات ژل فاز که متناسب با کنتیک ها می توانند از 30 ثانیه تا 1 ساعت زمان اضافی ببرند جدا شود.

توجه به این نکته مهم است که بدانیم داربست نتیجه تفکیک فازی و سپس ژل شدگی است و اگر این ترتیب برعکس شود به جای داربست ژل به دست می آید.

تغییر فاز در 75% آب در زمان وقوع ژل شدگی قبل از تفکیک فاز سبب غیر قابل نفوذ شدن ژل ها در برابر سلول ها می شود.

بنابراین بهترین وضعیت حفظ تعادل 80% آب در فرمولاسیون است تا حالت نفوذ پذیری داربست در برابر سلول حفظ شود.

محدوده اندازه خلل و فرج متناسب با فرمولاسیون از 2 تا 80 تغییر می‌کند.

-استخراج ساکس هلت داربست SOXHLET EXTRACTION OF SCAFFOLD تحقیقات چیفکوفی و همکارانش نشان داد که آ‎ب استخراج شده از ژل های PHEMA و تزریق شده به درون پوست موش ها نسبتاً دردناک است.

بنابراین خارج کردن همه عوال سمی از اسفنج های PHEM قبل از اعمال به بافت بسیار مهم است.

همچنین اگر اکریلامید که یک نورو توکسین قدرتمند است یک کومونومور باشد اهمیت دوچندان می شود.

روش استخراج ساکس هلت راحت ترین و مؤثرترین شیوه برای خارج سازی مونور باقیمانده و یا هر آغاز گر غیر فعال دیگری است.

نمونه های کوچک را می توان در انگشتانه یا کاست رشد قرار داده تا از کشیده شدن آنها به درون جریان خروجی محفظه نمونه جلوگیری کرد.

اگر اسفنج های اصلاح شده نسبت به دما حساس بوه و یا شامل ذرات تخریب پذیر باشند می توان استخراج را در دمای پائین توسط دستگاه جانبی سردساز متصل به محفظه نمونه یا با سیستم ساکس هلت به اجرا در آورد.

در زمان کار تحت خلاء از تطبیق ساز مدخل مویرگ خونی در یک فلاسک با کف گرد و دو گردنه جهت تولید رشته ای از حباب های هوا برای جلوگیری از ضربه استفاده می شود.

استخراج اسفنج های PHEM معمولاً درطول شب انجام می شود.

حداقل تعداد شستشوهای ضروری برای خارج کردن اجزا سمی نامشخص است اما مقدار یک یا دو استخراج ml40 شاید کافی باشد.

از روغن کاری بین مفاصل کاملاً حذر کرده و چربی احتمالی را با کلروفرم یا استون به خوبی پاک می کنیم.

-استریلیزاسیون (سترون کردن)STERILIZATION اسفنج های PHEMA را میتوان تحت اتوکلاو قرار داده و ترجیحاً در آب داخل محفظه درب دار غیر پیچشی برای جلوگیری از افزایش فشار، غوطه ور ساخت.

اسفنج های PHEMA در اثر حضور در چنین دماهایی کمترین تخریب را از خود نشان می دهند.

از پرتودهی گاما ، (KGy 25) نیز می توان بهره گرفت.

التبه احتمال تغییر جزئی حجم شبکه یا بریدگی زنجیر وجود دارد.

-نفوذ سلولی داربست هاCELLULAR PENETRATION OF SCAFFOLDS روش های استاندارد کشت سلولی را می توان برای کاشت اسفنج هاPHEMA استریل در محل بافت مورد نظر یا بارور کردن آنها با سلول ها برای کشت آزمایشگاهی به کار برد.

برای بالا بردن نفوذ سلولی اسفنج های PHEMA می توان «پوسته» متخلخل کمتری که نمونه قالب گیری شده را احاطه کرده است برداشت.

این کار را می توان با ماشین تراش (بر روی نمونه های منجمد) یا توسط تیغ (داربست های نیمه منجمد شده در دمای C0 78- به مدت 10 دقیقه) انجام داد.

از غوطه ور شدن اسفنج ها در نیتروژن مایع باید حذر کرد چرا که سبب از هم پاشیدن اسفنج می شود.

البته این روش برای تصویر برداری میکروسکوپی اسکن الکترون (SEM) می تواند مفید باشد.

(استخراج ساکس هلت، ترک خوردگی را کاهش می دهد) مطلوب است که اسفنج های PHEMA ساخته شده در حمام اولتراسونیک بدون پوسته باشند.

البته گرمای تولید شده در سونیکاتور می تواند بر جنبش بسپارش اثر بگذارد.

-پردازش ساختار بافتHISTOLOGICAL PROCESSING مورفولوژی کلی و تغییرات فوق ساختاری در برون کاشتی ها یا اسفنج های کشت شده PHEMA را میتوان توسط میکروسکوپ چشمی و میکروسکوپ انتقال الکترون (TEM) بر بافت پردازش شده در صمغ اپوکسی مشاهده کرد.

کاشتنی های خارج شده از بدن باید به مدت 48-24 ساعت در 5/2% گلوتارآلدهید نگهداری شده و از قبل در 1% اسمیوم تتراکساید تثبیت شوند.

نمونه ها توسط محلول های درجه بندی شده اتانول آب گیری شده و سپس در اکسید پروپیلن غوطه ور می شوند.

سپس نمونه به وسیله صمغ اپوکسی و تعویض روزانه صمغ قدیم با صمغ تازه به مدت 72 ساعت پالایش می شوند.

قسمت های نیمه نازک (2) برای میکروسکوپ چشمی و قسمت های فوق نازک (nm1/0) برای TEM توسط یک فرامیکروتوم (فراریزبر) با تیغه الماس بریده می شوند.

لکه های بررسی شده برای آزمایش نور شامل هماتوکسیلین و ائوسین، قرمز الیزارین (روناس)، سه رنگ طبیعی (تری کروم) میسون و آبی تلوئیدین می شود.

به غیر از لکه آبی تلوئیدین، بخش های دیگر باید با غوطه ور شدن به مدت 2 دقیقه در اتوکسید سدیم وهیدراته شدن از طریق محلول های درجه بندی شده اتانول پلاستیکه شوند.

تجمع تحریک آمیز سلول را در اسفنج های برون کاشتنی PHEMA را می توان توسط تمرکز ایمنی شیمیایی یاخته های ماکروفاژ با استفاده از به کارگیری پادتن ها بر ماکروفاژهای بخش های منجمد شده و پارافینی بافت تثبیت شده در 2% پارافرم آلدئید شناسائی کرد.

نوتروفیلها را می توان با اعمال ‎آنزیم شیمی بافت بر بخش های منجمد تثبیت شده در سیتوات – استون فرم آلدئید نگهداری شده در کلرواستات AS-D نفتال در PH 3/6 به مدت 15 دقیقه در تاریکی و دمای C0 37 شناسائی کرده و توسط هماتوکسیلین با لکه ها مقابله کرد.

عبارت ماهیچه صاف اکتین به عنوان علامت شیمیایی تبدیل مایوفیبربلاست به کار رفته و توسط روش های متمرکز سازی ایمنی یاخته شیمیایی در کشت سلولی قابل شناسائی است.

محصول ماتریس برون سلولی در برون کاشتنی ها PHEMA توسط اتورادیو گرافی شناسائی می شوند.

کلاژن تولید شده توسط سلول ها ونوع آن را می توان با استفاده از پرولین H ]3 –3 و 2[- (مقدماتی) و تمرکز ایمنی یاخته شیمیایی انواع کلاژن I- VI با پادتن های انسانی و کلاژن گاوی شناسائی کرد.

این موضوع نشان می دهد که اسفنج های PHEMA هم نفوذ و هم ته نشینی سلول را میسر ساخته و یک داربست بافت سه بعدی پایدار و اشکل می دهد.

چگالی و زیست پذیری سلول را میتوان با استفاده از تصحیح روش لک اندازی فلورسانت که توسط پول و همکارانش صورت گرفت انجام داد.

این روش بسیار حساس و قابل اطمینان از دو نوع رنگ فلورسانت استفاده می‌کند: 5-کلرومتیل فلورسئین دی استیت (CMFDA) و اتیدیم و همودیمر (هم پار) 1 که به ترتیب جهت شناسایی سلول های زنده و مرده مورد استفاده قرار می گیرد.

نمونه های بافتی برون کاشته شده با اهداف متفاوت همراه با CMFDA و یا با اتیدیم همودیمر 1 به مدت 24 ساعت در C0 37 نگهداری می شوند.

بعد از آن گونه ها به طور مختصر در 2% پارافرمالدهاید تثبیت شده و در دمای بهینه برش محیط پیرامون منجمد (OCT) می شوند.

بخش های منجمد شده را می توان بر روی اسلایدهای پوشیده شده با آمینو پروپیل تری تکسی سیلان جمع آوری کرده و در میکروسوپ فلورسانت مشاهده نمود و بدین ترتیب تحلیل نیمه کمی از سلول های زنده و مرده به عمل آورد.

-اشارات و فوت و فن هاTIPS AND KNOW – HOW نرخ منومر در آب تنها فاکتور مهم در کنترل مورفولوژی نهایی است .

متغیرهای دیگری که می توانند بر مورفولوژی نهایی تأثیر بگذارند شامل دمای زمان بسپارش، مقدار اکسیژن حل شده در ترکیب منومر و غلظت و نوع مواد شیمایی در ترکیب منومر است.

تثبیت این پارامترها در زمان بررسی اثر تغییر یکی از آنها بسیار مهم است.

HEMA باید یک سیال صاف بوده و اگر هر گونه زردی در آن مشاهده شود باید منومر خارج گردد.

HEMA معمولاً قبل از استفاده تحت خلاء تقطیر می شود و در صورتی که باز دارنده ها (ممانعت کننده ها) و هیدروکوئینین مونومتیل اتر (MEHQ) را از آن خارج کنیم زمان ذخیره سازی (نگهداری) آن کوتاه می شود.

اگر HEMA با خلوص بالا حاوی کمتر از ppm50 ، MEHQ خریداری شود و بطری آن به طور مرتب تعویض شودHEMA را می توان بسادگی پس از دریافت استفاده کرد.

بهتر است که منبع ویژه HEMA را انتخاب کرده و مقادیر کمی از آن به عنوان توزیع کننده، نگهداری شود و هر 6 ماه یک بار یک بطری جدید سفارش داده شود.

معمولاً مقداری اتیلن دی متا اکریلیت ‍(EDMA) در HEMA خریداری شده وجود دارد که برای بررسی حساسیت با تخریب پذیری می توان EDMA را به وسیله استخراج در هگزان خارج کرد.

برای استفاده عمومی، نیازی به خارج سازی EDMA از HEMA نبوده و برای ایجاد همخوانی (سازگاری) بین دسته ها توصیه می شود که HEMA را توسط غلظت مشخصی از EDMA خنثی کرد.

این کار از واکنش کنتیک متغیرها جلوگیری کرده و خطاهای ناشی از رهایش مقادیر کم EDMA به ترکیب منومر را برطرف می‌کند.

عامل شبکه ساز با اثر گذاری بر کنتیک های واکنش مصرف HEMA و همچنین کنتیک های تفکیک فاز در برابر ژل شدگی نقش پیچیده ای را در آرایش داربست بازی می‌کند.

برخلاف ژل های PHEMA ارتباط زیادی بین غلظت عامل شبکه ساز و استحکام داربست های PHEMA وجود ندارد غلظت معمول به کار رفته EDMA برای داربست ها در حدود %wt25/0 –1/0 است.

محلول تازه پرسولفات آمونیوم (APS) باید برای هر فرمولاسیون تهیه شده و ساده ترین روش برای این فرایند تکراری سنجش دقیق g(*) 1/0 و پوشاندن ظرف با آب تا g(*)1 است.

وزن ظرف باید در تعادل وزنی بین APS اضافی و آب محاسبه شود.

اسفنج های PHEMA ساخته شده با غلظت های کم APS معمولاً ضعیف و چسبنده هستند.

در صورتی که تمایل به واکنش آرام داشته باشیم به جای بازدارنده می توانیم از عامل شتاب دهنده با غلظت ضعیف تر استفاده کنیم.به طور کلی غلظت APS باید بیشتر از wt%3/0 غلطت منومر باشد.

برای غلظت های پائین تر منومر ممکن است نیاز به غلظت بالاتر باشد.

برای مثال برای یک ترکیب 10:90، HEMA و آب، غلظت wt%5/0 توصیه می شود.

TEMED به محض دریافت با توزیع در ترکیب منومر توسط میکروپیپت استفاده می شود.

TEMED یک اهدا کننده الکترون بسیار قدرتمند تر از دیگر عامل های شتاب دهنده (تسریع کننده) مانند متابی سولفات سدیم (SMBS) و اسید اسکوربیک بوده و در نتیجه نرخ واکنش آن بسیار سریع تر است.

هنگامی که عامل شتاب دهنده SMBS باشد لایه لایه شدگی و استقرار ورفولوژی مشاهده می شود.

برای خارج کردن اکسیژن حل شده می توان گاز نیتروژن یا هلیوم را برای مدت زمان مشخصی (~15 دقیقه) به شکل حباب در ترکیب منومر وا رد کرده و یا اینکه میتوان منو ر را به صورت عرضه شده (تحت پردازش قرار نگرفته) مصرف کرد.

اسفنج PHEMAرا که با گاز خنثی حباب دار شده اند را با آنهایی که نشده اند مقایسه نکنید.

خروج اکسیژن حل شده بر نرخ واکنش و در نتیجه مورفولوژی تأثیر می گذارد.

در صورت استفاده از منومر عرضه شده انسجام (هم خوانی) هر ترکیب ضروری است.

-نتایج و خط مشی آیندهCONCLUSIONS AND FUTURE DIRECTIONS تهیه داربست نفوذ پذیر سلولی PHEMA ساخته شده توسط بسپارش HEMA در آب اضافی و اتوکلاوکردن آنها راحت بوده و گران نمی باشد.

علاوه بر این طرح شیمی ارائه شده در این فصل اجازه ساخت مکرر داربست های PHEMA را می دهد.

داربست های PHEMA در آب فرسوده نشده و تولید محصولات تخریبی نمی کند و حد فاصل سلول- سطح داربست پایدار است.

اصلاح سطح مانند افزودن پپتید یا مولکول های زیست فعال تترینگ به این دار بست مصنوعی امکان پذیر بوده و از عملکرد هیدروکسیل بهره می برد.

اسفنج های PHEMA را میتوان با مقادیر بسیار کم عامل شبکه ساز (wt%05/0~) ساخته و هر گونه ناخالصی EDMA قابل حذف کردن است.

در صورتی که داربست های PHEMA جهت تخریب اصلاح شوند، آزمایشات ارزیابی تورم کاشتنی و محصولات سمی و تخریب پذیر لازم خواهد بود.

تشکیل داربست توسط بسپارش نسبت به روش های دیگر تهیه داربست دارای مزایایی است.

داربست در حین بسپارش از نواحی عاری از پلیمر و غنی از پلیمر تشکیل شده و بدین ترتیب شکل و مورفولوژی را می توان بالقوه توسط تحریکات خارجی از قبیل نیروهای سانتریفوژ یا نور تغییر داد.

چنین کنترلی بر شکل داربست، می تواند منجر به چندگانی مورفولوژی ها و هندسه آنها شده که برای کاربردهای مهندسی بافت مطلوب است.