دانلود تحقیق تولید داربست های پلیمری پلیمریزاسیون (بسپارش)

پیشگفتار

داربست های به دست آمده از طریق روش بسپارش کانیدهای خوبی برای مهندسی بافت به شمار رفته و به دلیل سهولت ساخت نسبت به روش دیگر ساخت داربست ارجحیت دارند. با وجودیکه پلیمرهای مختلفی را می توان به این روش بسپارش کرد. اما تعداد کمی از آنها منجر به داربست هایی با قابلیت دخول سلول یا همان داربست های متخلخل می شوند. برای نمونه پلی اتیلن گلیکول- مالتی-اکریلیت و پلی 2- هیدروکسی اتیل متا اکریلات (PHEMA) می توانند به صورت شبکه ای یا به حالت اصلی بسپارش شوند، هر چند ساختار ایجاد شده به جای داربستی با خلل و فرج های بزرگ درهم برای نفوذپذیری سلول ها به شکل ژل می باشد. با دستکاری (تغییر) شرایط بسپارش می توان داربست های متخلخل از PHEMA و پلی- ان- 2-هیدروکسی پروپیل متا اکریلامید (PHPMA) ایجاد کرد. به طور خلاصه ترکیب منومری (تک پار) در حضور حلالی که منومر در آن قابل حل ولی پلیمر غیر قابل حل است، درون قالب بسپارش می شود. گذار حلالیت درخلال بسپارش منجر به دو فاز می گردد، ساختار زیستی پیوسته پلیمر و حلال (شکل 1-63) بدین ترتیب، داربست تولید شده در نتیجه بسپارش برای ایجاد خلل و فرج های در هم نیازی به پالایش پروژن ندارد. برای داربست های PHEMA با قابلیت دخول سلول که اغلب به نام اسفنج های PHEMA خوانده می شوند حلال مازاد معمولاً آب است.

اسفنج های PHEMA نخستین بار در سال 1960 ساخته شده و اولین کاربرد بالینی آنها افزایش حجم پستان و جایگزینی عضروف بینی بود. اسفنج‏های PHEMA قابلیت تحمل اتوکلاو را داشته و به سادگی به اشکال مختلف تغییر فرم می دهند و به خاطر خصوصیات فیزیکی اسفنجی برای جراح مانند بافت نرم هستند. برخی از محققین ، اسفنج های PHEMA را جایگزین بافت نرم با قابلیت کاربردی متنوع نامیده اند. با این حال آهکی شدن آنها در محیط آزمایشگاه در مدت زمان طولانی سبب کند شدن سرعت توسعه اسفنج های PHEMA تا اوایل 1990 یعنی زمانی که چیریلا از اسفنج های PHEMA برای پروژه قرنیه مصنوعی استفاده کرد، شد. اسفنج های PHEMA از آن موقع به بعد به عنوان حاشیه متخلخل قرنیه مصنوعی که باموفقیت های بالینی فراوانی مواجه شد توسعه یافتند. داربست های PHEMA قابل نفوذ برای سلول ها بوده و به همین دلیل به عنوان یک قلاب (نگهدارنده) بین بافت  قرنیه و هسته مرکزی شفاف غیرقابل نفوذ به کار برده می شود همچنین میتوان با تلفیق اسفنج های PHEMA با کاشتنی چشمی (اربیتال) سبب نفوذ ماهیچه ها به داخل اجزاء PHEMA شد.

تست های آزمایشگاهی و درون بدنی اسفنج های PHEMA لزوم نفوذ (هجوم) سلول را برای کاربردهای مهندسی بافت ثابت کرده اند. اشکال مختلف داربست به واسطه پیامد بسپارش اجازه تغییر ساختار مصنوعی را در حین سنتز می دهد. این فصل روش تحلیل ساخت اسفنجهای PHEMA قابل تولید در آزمایشگاههای تحقیقاتی را تشریح می‌کند.

معرف ها(شناسگرها)REAGENTS                                                                    سیستم های آغاز کننده و منومر اسفنج های PHEMA گران نبوده و مواد شیمایی فوق آماده مصرف هستند. مواد شیمیایی فهرست شده در جدول 1-63 و 2-63 از آلیدرچ (میلواکی ایالت ویسکانسین) قابل خریداری هستند. آب به کار رفته معمولاً مقطر بوده و یون زدایی شده است و دارای مقاومت  M18 می باشد، میلی پور میلی رو مثبت 10 و میلی- کیویواف مثبت (بدفورد، ایالت ماساچوست)

-روش هاMETHODS                                                                                       مراحل کلیدی در سنتز اسفنج های PHEMA برای مقاصد پزشکی- زیستی عبارتند از:

تهیه قالب

تهیه فرمولاسیون

اعمال- تزریق فرمولاسیون به قالب

بسپارش و تشکیل داربست

استخراج ساکس هلت (soxhlet) داربست

استریلزاسیون (سترون کردن)

نفوذ سلولی داربست

پردازش ساختار بافت

-تهیه قالبMOLD PREPARATION                                                                قالب ها باید قبل از تهیه فرمولاسیون بسپارش آماده باشند. قالب باید هم در دسترس بوده (به عبارت دیگر شیشه یا پلی پروپیلن) و هم به طور کامل با الکل قابل پاک کردن باشند (به عبارت دیگر تفلون). از آنجا که PHEMA به پلی استایرن فولاد و لوله تایگون می چسبد حفظ کیفیت سطوح در هنگام استفاده از این مواد به عنوان قالب مشکل است.

-تهیه فرمولاسیون FORMULATION PREPARATION                                  

تهیه ترکیب منومر ساده است: ابتدا همه سیالات فهرست شده در جدول 1-63 را به غیر از عامل شتاب دهنده ( - تترامتیل اتیلن دیامین، TEMED ) در ظرف شیشه ای به هم اضافه می کنیم. ظرف را به مدت 3 دقیقه در حمام اولتراسونیک-  قرار می دهیم و مراقب هستیم تا دمای حمام ثابت باقی بماند. بعد از اضافه کردن عامل شتاب دهنده، ترکیب را برای 30 ثانیه به آرامی تکان داده یا می غلطانیم. از حرکت شدید و تند خودداری می کنیم زیرا که ممکن است سبب ورود اکسیژن به داخل ترکیب شده و جنبش بسپارش را تغییر دهد. فرمولاسیون فوق را می توان اکنون به داخل قالب تزریق کرد.

-اعمال-تزریق فرمولاسیون به قالب

DISPENSING / INJECTION FORMULATION INTO MOLDS                   

فرمولاسیون به دست آمده را میتوان با یک سرنگ یک بار مصرف با سوزن درجه 18 به قالب مورد نظر که دارای شکل و ابعاد مطلوب محصول نهایی است تزریق نمود. جلوگری از ایجاد حباب در زمان تزریق فرمولاسیون از اهمیت ویژه ای برخوردار است. فرمولاسیون باید قبل از رخ دادن تفکیک فاز (به عبارت دیگر سفید شدگی) تزریق شود.

-بسپارش و تشکیل داربست

POLYMERIZATION AND FORMATION OF SCAFFOLD                       

از آنجا که دما بر جنبش بسپارش تأثیر می گذارد حفظ دمای ثابت قالب در طول بسپارش ضروری است. زمان بسپارش در حدود 10-2 ساعت در دمای اتاق بوده و به ترکیب دقیق فرمولاسیون بستگی دارد. فرمولاسیون های حاوی آغاز کننده ها و یا عامل های شبکه ساز کمتر معمولاً به زمان بیشتری برای شکل گیری قالب نیاز دارد. قالب ها معمولاً در طول شب باقی مانده و یا در فری با دمای C 0 50 به مدت 3 ساعت پس از سپری شدن 10-2 ساعت نخستین از تبدیل کامل و باقی ماندن کمترین میزان منومرها قرار داده می شود. تفکیک فاز و ژل سازی دو تغیر فیزیکی هستند که در حین بسپارش قابل مشاهده هستند. تفکیک فاز یا سفید شدگی فرمولاسیون را می توان با طیف سنجی در nm550 پس از 60-5 دقیقه (به عکس العمل کنتیک ها بستگی دارد) تشخیص داد. استفاده از کووت های پلی استایرن یک بار مصرف برای سنجش نور بهترین انتخاب است چرا که پلیمر به سطوح کوارتز می چسبد. بعد از تفکیک فاز، ترکیب در حالت سیال باقی مانده تا ذرات ژل فاز که متناسب با کنتیک ها می توانند از 30 ثانیه تا 1 ساعت زمان اضافی ببرند جدا شود. توجه به این نکته مهم است که بدانیم داربست نتیجه تفکیک فازی و سپس ژل شدگی است و اگر این ترتیب برعکس شود به جای داربست ژل به دست می آید. تغییر فاز در 75% آب در زمان وقوع ژل شدگی قبل از تفکیک فاز سبب غیر قابل نفوذ شدن ژل ها در برابر سلول ها می شود. بنابراین بهترین وضعیت حفظ تعادل 80% آب در فرمولاسیون است تا حالت نفوذ پذیری داربست در برابر سلول حفظ شود. محدوده اندازه خلل و فرج متناسب با فرمولاسیون از 2 تا 80 تغییر می‌کند.

-استخراج ساکس هلت داربست

SOXHLET EXTRACTION OF SCAFFOLD                                                  تحقیقات چیفکوفی و همکارانش نشان داد که آ‎ب استخراج شده از ژل های PHEMA و تزریق شده به درون پوست موش ها نسبتاً دردناک است. بنابراین خارج کردن همه عوال سمی از اسفنج های PHEM قبل از اعمال به بافت بسیار مهم است. همچنین اگر اکریلامید که یک نورو توکسین قدرتمند است یک کومونومور باشد اهمیت دوچندان می شود. روش استخراج ساکس هلت راحت ترین و مؤثرترین شیوه برای خارج سازی مونور باقیمانده و یا هر آغاز گر غیر فعال دیگری است. نمونه های کوچک را می توان در انگشتانه یا کاست رشد قرار داده تا از کشیده شدن آنها به درون جریان خروجی محفظه نمونه جلوگیری کرد. اگر اسفنج های اصلاح شده نسبت به دما حساس بوه و یا شامل ذرات تخریب پذیر باشند می توان استخراج را در دمای پائین توسط دستگاه جانبی سردساز متصل به محفظه نمونه یا با سیستم ساکس هلت به اجرا در آورد. در زمان کار تحت خلاء از تطبیق ساز مدخل مویرگ خونی در یک فلاسک با کف گرد و دو گردنه جهت تولید رشته ای از حباب های هوا برای جلوگیری از ضربه استفاده می شود. استخراج اسفنج های PHEM معمولاً درطول شب انجام می شود. حداقل تعداد شستشوهای ضروری برای خارج کردن اجزا سمی نامشخص است اما مقدار یک یا دو استخراج ml40 شاید کافی باشد. از روغن کاری بین مفاصل کاملاً حذر کرده و چربی احتمالی را با کلروفرم یا استون به خوبی پاک می کنیم.

-استریلیزاسیون (سترون کردن)STERILIZATION                                         اسفنج های PHEMA را میتوان تحت اتوکلاو قرار داده و ترجیحاً در آب داخل محفظه درب دار غیر پیچشی برای جلوگیری از افزایش فشار، غوطه ور ساخت. اسفنج های PHEMA در اثر حضور در چنین دماهایی کمترین تخریب را از خود نشان می دهند. از پرتودهی گاما ، (KGy 25) نیز می توان بهره گرفت. التبه احتمال تغییر جزئی حجم شبکه یا بریدگی زنجیر وجود دارد.