دانلود مقاله پروتئین های مثوک حرارتی

پروتئین های مثوک حرارتی همانطور که می دانید یک دسته از عواملی که در رشد و فعالیت میکروارگانیسم ها موثر هستند عوامل محیطی می باشند که به 2 دسته فیزیکی و شیمیایی تقسیم می شوند.

یکی از مهمترین این عوامل که به عنوان یک عامل فیزیکی مطرح می گردد گرما ( حرارت) می باشد.

حرارت بر کلیه فعل و انفعالات سلولی اثر دارد و متابولیسم سلول را تحت تاثیر قرار می دهد.

اگر حرارت تاحد معینی افزایش یابد واکنش ها را تسریع می کند ولی اگر از حد معین تجاز کند فعالیت های متابولیکی را متوقف می کند زیرا باعث می گردد که پروتئین ها ماهیت خود را از دست بدهند، دناتوره گردند، آنزیم های مهم و اساسی سلولی از کار افتاده روی غشا و فشار اسمزی اثر کرده در نتیجه نقل و انتقال مواد را تحت تاثیر قرارداده و روی مواد غذایی کاهش می یابد و نفوذ مواد سمی و زاید افزایش پیدا کرده و خروج آنها کند می گردد.

در نتیجه فعالیتهای سلولی مختل می گردد.

همچنین دما روی فعالیت هایی مثل تولید اسپور، تولید پیگمان، عمل تخمیر و تنفس هم اثر می گذارد.

حرارت اپتیمم: مناسبترین درجه حرارت برای رشد یک باکتری را گویند.

حرارت لتال: حرارت کشنده باکتری ها که سبب می گردد تمام میکروارگانیسمهای یک گونه درعر 10 دقیقه کشته شوند.

ترموتولورانس : تحمل گرمایی چاپرون ها : مولکول هایی پروتئینی هستند که برای فولدینگ و تثبیت پروتئین ها اختصاص پیدا کرده اند و به پروتئین های جدید در حال ترجمه متصل می گردند.

Folding : تا شدگی پروتئین ها Unfolding :باز شدن تای پروتئین Refolding : تاخوردگی مجدد پروتیئن باکتری ها از نظر نیازهای حرارتی به 3 دسته تقسیم می شوند: ترموفیل ها یا گرما دوست ها با دمای opt بالای 45 درجه که در مناطق گرم، خاک و کود و ...

زندگی می کنند و از نظر صنعتی نیز مهم هستند.

باکتریها هایپرترموفیل نیز گروهی از باکتری ها هستند که در حرارت بسیار بالا مثل مناطق آتشفشانی زندگی می کنند و قادر به رشدهستند و opt بالای 80دارند.

مثل Bacillus steavo thermophilus گروه دوم مزوفیل ها هستند مثل E coli که در حرارت های میانی رشد می کنند گروه سوم نیز ساکروفیل ها هستند مثل polaromonas که در حرارت های زیر 20 و حتی زیر صفر صفر رشد می کنند.

به طور کلی 2 پاسخی که سیستم های بیولوژیکی به حرارت می دهند شامل موارد زیر است: 1- fiuidity of the lipid bllayer 2- activity of enzyme systems مورد اول و افزایش روانی غشای 2 لایه لیپیدی می تواند نهایتاً باعث تراوش یک سری از یون ها به خارج گردد که آرکیاها این مسئله را با داشتن یک سری اتصالات اتدی حل کرده و مقاوم شده اند.

مورد دوم فعالیت سیستم آنزیمی است که به ازای هر 10 درجه باعث 2 برابر شدن فعالیت می گردد که این دارای محدودیت است.

اغلب ترموفیل ها آنزیمهایی دارند که دارای مقاومت حرارتی هستند از جمله با داشتن یکسری اتصالات و باندهای اضافه.

از جمله پاسخهای مهمی که ارگانیسم ها به تغییرات دمایی می دهند القا و تحریک تولید یک سری پروتئین ها می باشد که به 2 دسته تقسیم می گردند: 1- cold shock pro 2- Heat shock pro Hsp ها 2 وظیفه کلی دارند که در شرایط فیزیولوژیکی به عنوان چایرون های مولکولی فعالیت می کنند و کاتالیز refoding پروتئین های دناتوره شده و کمک به بلوغ pro های تازه نستز شده و ممانعت از تراکم aggve pation پروتئیها.

دوم اینکه در پاسخ به استرسهای سلولی نقش دارند از جمله به طور عمده در برابر افزایش حرارت و به میزان کمتر از برابر فلزات سنگین، حضور رادیکالهای اکسیژن و اتانول و ...

تولید می گردند.

( 2 و 3 و 4 ) بدست آوردن ترموتولورانس به افزایش بقا ارگانیسم ها در حرارت های کشنده برمی گردد وقتی که برای یک مدت زمان کوتاه در معرض حرارت های بالا و کشنده قرار بگیرند.

این پاسخ لازمه سنتز تعداد کمی از پروتئین ها است که بنام HSP ها شناخته شده اند.

تحقیقات بسیار زیادی برای بررسی این فرضیه انجام شده و نقش HSPها در مقاومت گرمایی مشخص گردید.

2 نتیجه کلی از این تحقیقات بدست می آید: 1- HSP ها حقیقتاً نقش مهم را در بدست آوردن مقاومت گرمایی بازی می کنند.

2- گونه های مختلف از استراتژی های مختلفی برای بدست آوردن مقاومت گرمایی استفاده می کنند ( با استفاده از HSPها و دیگر ماکرومولکول ها) اغلب تحقیقات انجام شده روی باکتری های ترموفیل فوکوس کرده اند و تعداد کمی نیز بر روی ترموفیل ها.

( 1) HSP ها اولین بار بعد از اینکه سلول ها به درجه حرارت های بالا عرضه گردیدند شناسایی شدند، در واقع به عنوان ترکیبات حیاتی از یک مکانیسم دفاعی سلولی بسیار حفاظت شده برای حفظ حیات سلول تحت شرایط محیطی شناخته شده اند.

این ها در پاسخ به عوامل یادشده در بالا همچنین فلزات سنگین و التهاب و عفونت ایجاد شده توسط پاتوژن ها بیان می گردند و در چند پروسه ضروری برای عملکردهای سلولی تحت شرایط فیزیولوژیکی دخالت دارند.

HSPها پروتئین هایی مربوط به استرس های سلولی بسیار محافظت شده اند که در هر ارگانیسم از باکتری ها تا انسان حضور دارند.

اولین توضیح از یک پاسخ سلولی به فشار حرارت بیش از 37 سال پیش داده شد.

این اولین بار مشاهده شد در سال 1962 که کروموزومهای غدد بزاقی یک مگس سرکه Drosophila meanogaster یک الگوی puf fing را بعد از قرار گرفتن در معرض حرارت نشان داد.

اولین محصول ژنی که در این پافینگ کروموزومی دخالت داشت 12 سال بعد شناسایی شد و heat shock protein نام گرفت.

از آن زمان به بعد بسیاری از تحریک کننده های دیگر که مسئول پاسخ شوک حرارتی بودند شناسایی شدند و مکان کروموزومی ژن های مربوط به این Pro ها نیز مشخص شدند.

ژنها تعیین توالی شدند و کانفور فی شن pro های حاصل شرح داده شد و مکانیسم فعالیت ژن با فاکتورهای رونویسی شوک حرارتی مشخص گردید.

از آنجا که پاسخ شوک حرارتی یک مکانیسم حیاتی سلولی است، این قابل فهم است که HSP ها در رشته های پزشکی قابل توجه هستند.

تمام ارگانیسم ها با سوئیچ آف کردن سنتز تعداد زیادی pro ها و آغاز سنتز میزان زیادی از HSP ها به شوک ها پاسخ می دهند.

حتی ارگانیسم های ترموفیل که حرارت Opt رشدشان بین 50 تا 90 درجه میباشد نیز به افزایش ناگهانی حرارت با افزایش سریع بیان HSP ها پاسخ می دهند.

ترکیب آمینواسیدی HSPها در طول تکامل خیلی تغییر نکرده است و HSPهای بسیاری ارگانیسم ها بسیار شبیه یکدیگر است ( ساختمان آنها حفظ شده است).

برخی اعضای فایل HSP با استرس القا شده در حالی که دیگر اعضا در حرارتهای نرمال هم بیان می شوند.

( 4 ) میکروارگانیسم های هایپر ترموفیل که می توانند در 100 درجه یا بالاتر رشد کنند اکنون به خوبی مطالعه شده اند اگرچه در رابطه با پاسخ های آداپتیو آنها در برابر حرارت های بسیار بالا میزان اطلاعات کمی وجود دارد.

HSP های برپایه وزن مولکولی شان به 5 Class تقسیم می گردند: HSP های 60 و 70 و 90 و 100 و HSP Small ها.

HSP Small ها یا s HSPs یک کلاس متداول از HSP ها هستند و رنج وزن مولکولی آنها از 15 تا 45 KDa می باشد و آنها بطور نرمال از کمپلکسهای چند زیر واحدی ( مولتی ساب یونیت) از 200 تا 800 KDa تشکیل می شوند.

برخی از s SHP ها در حالت عادی در سلول های بدون استرس حضور دارند ولی سایرین با استرس القا می گردند.

اغلب s HSP ها به Pro های x- کریستالین که در لنزهای چشم یافت می شوند اشتراک فعالیت دارند و از نظر عملکردی نیز به عنوان چاپرون های مولکولی شناخته شده اند.

( 3) القا HSP ها در ابتدا در پروکاریوت ها و هم در یوکاریوت ها در سط رونویسی تنظیم می گردد و در ارگانیسم های مختلف عملکردی مشابه دارند و در طول شوک حرارتی رونویسی از آنها با القای ژن های آنها افزایش می یابد در پروکاریوت ها پاسخ شوک حرارتی بعد از 10 دقیقه معمولاً خاموش می شود (2) در اینجا پاسخ های شوک حرارتی و مکانیسم های تنظیمی و انواع HSP ها و HSP s های تولیدی در باکتری های مختلف شرح داده شده است از جمله: 1- حصول ترموتولورانس در 3 دومین فیلوژنتیکی شامل 3 میکروارگانیسم: Bacillus Caldly ticus ، Sulfo lobus shibatae ، Thermomyces lanuginosus از 3 حوزه (Bacteria , Archaea , Eucarya) 2- Borre lia Burydorferi 3- بدست آمدن ترموتولورانس و شوک حرارتی در آرکیاباکتری اکستریم ترموفیل sulfo lobus sp.

Stran B12 4- مکانیسم و عملکرد HSP sها درآریکای هایپرترموفیل pyrococus furiosus 5- باکتری ترمواسیدوفیل آرکیایی sulfolobus tokodaii strain 7 6- باکتری مزوفیل Ecoli بطور کامل و دقیق 7- باکتری Bacillus subtilis عنوان * بررسی حصول ترموتولورانس و HSP ها در ترموفیل ها از 3 حوزه فیلوژنتیکی: ارگانیسم های ترموفیل از هر 3 حوزه ژنتیکی باکتری ها و آرکیاها و یوکاریوتها بعد از شوک حرارتی مقاومت گرمایی بدست آورده اند.

Bacillus caldoly ticus در 60 درجه رشد داده شد و در 69 درجه برای 10دقیقه شوک گرمایی داده شد و مقاومت گرمایی تا 74 درجه نشان داد.

Sulfolobus shibatae در 70 درجه رشد داده شد و شوک حرارتی در 88 درجه برای 60 دقیقه، مقاومت گرمایی تا 95 درجه نشان داد.

Thermomyces ;amigompsus در 50 درجه رشد داده شد و شوک حرارتی در 55 درجه برای 60 دقیقه مقاومت گرمایی تا 85 درجه را نشان داد.

تعیین سنتز pro در طول شوک حرارتی اختلاف در HSP های عمده برای هرگونه را آشکار کرد.

برای B.caldoly ticus یک پروتئین kda 70 غالب است در حالی که s.shibatae یک KDa pro 55 و برای T .lanuginosos pro های 31 تا 32 KDa غالب هستند.

همچنین معرف هایی که سنتز pro های نرمال را در طول شوک حرارتی می شکند مانع افزایش مقاومت گرمایی شد.

( 1 ) همچنین معرف هایی که سنتز pro های نرمال را در طول شوک حرارتی می شکند مانع افزایش مقاومت گرمایی شد.

( 1 ) * حصول ترموتولورانس : روش مورد استفاده مشابه سایر پروسه های توضیح داده شده است، اساساً یکی از 2 نمونه یکسان از یک کشت در حال رشد فعال شوک حرارتی داده شد در حالی که دیگری در حرارت معمول و آغازین رشد نگهداری می گردد.

در پایان دوره شوک هر 2 نمونه به یک حرارت کشنده انتقال داده شدند و بقای آنها بصورت تابعی از زمان نشان داده شد.

نمونه های باسیلوس در 60 درجه رشد داده شدند با شیک شدید در محیط مایع BC محتوی 5/0 درصد کلوکز و 2/0 % گاز امینواسید و NH4CL و در 69 درجه برای 10 دقیقه شوک داده شدند و در یک حرارت کشنده 74 درجه قرار داده شدند.

سلول های زنده در محیط BC شمارش شدند دارای آگار و عصاره مخمر و تریپتون با یک شب انکوبه شدن در 60 درجه .

- نمونه های سولفولوبوس در 70 درجه رشد داده شدند با تکان ملایم در محیط مایع SS محتوی دکسترین و برای 60 دقیقه در 88 درجه شوک داده شده و در معرض 95 درجه قرار گرفتند و سلولهای زنده با تهیه رفت هایی از محیط SSشمارش شدند.

- سرانجام نمونه هایی از Conidia از ترموماسیس برای 4 ساعت در 50 درجه انکو به شدند با شیک در یک محیط YPS تغییر یافته ( محیط T1 ) که بالای 90درصد آنها رشد کردد.

در 55 درجه برای 60 دقیقه شوک داده شدند و در 58 درجه منتقل گردیدند و Conidia های زنده شمارش شدند با شمارش کلنی های میسلیوم که روی محیط T1 جامد و سخت شده با 2 درصد آگار بعد از 48 ساعت در 45 درجه از دقت ها رشد کردند.

- تحت شرایط آزمایش ها تمام 3 گونه ترموفیل ترموتولورانس را بدست آوردند اگرچه زمان پاسخ آنها ومیزان تحمل آن ها متفاوت است ( شکل 1) اختلاف در حیات سلول ها با شوک حرارتی و بدون شوک به قدرکافی زیاد بود که علیرغم تفاوت بین آزمایش ها شکی وجود ندارد که برخی تطابق های مولکولی اتفاق افتاده است.

برای بررسی چگونگی وقوع این تطابق ها، تغییر در سنتز Pro در طول آزمایش ها نمایش داده شد.(1) * سنتز پروتئین های شوک حرارتی و الکتروفورز ژن : سنتز Pro در شرایط و حرارت های نرمال و حرارت های شوک با سلولهای pulse – labeling با methionine ‍[ S 35 ]- L تعیین گردید.

5 میلی متر نمونه از باسیلوس در فاز Log برای 5 دقیقه با 10 MC با میتونین در محیط BC نشان دار شدند با جایگزین کردن کارامینواسید با یک آمینواسید میتونین Free یک میلی لیتر از نمونه سولفولوبوس در فاز log با 10 MC از میتونین نشاندار برای 15 دقیقه در محیط استاندارد.

5 میلی لیتر نمونه Conidia از ترموماسیز که در محلول نمک شسته شدند و با 100 MC از میتونین برای 10 دقیقه در محیط T1 نشاندار شدند.

در پایان زمان Labeling سلول های باسیلوس و سولفولوبوس با سانتریفیوژ حاصل شدند و در محیط کشت شسته شدند و در SDS لایز شدند.

الکتروفور ژن SDS انجام شد و ژن با کوماسی بلو رنگ آمیزی گردید و آتورادیوگرافی آن انجام شد.

Conidia های labele شده از ترموماسیز توسط سانتریفیوژ جدا شده و در یک محلول نمکی با میتونین های unlabele شسته شدند و دوباره در 300 میلی لیتر از همان محلول حل شدند.

Conidia ها لایز شدند با تکرار سیکل هایی از freeze – thawing, sonication در 80 – درجه.

به دنبال آن با انجام سانتریفیوژ pro ها از مایع رویی رسوب داده شدند با 10درصد ice-cold از تری کلرو استیک اسید.

رسوب شسته شده توسط 5/0 ice- cold ml استون ، در خلا خشک گردید و دوباره در 150 m1 از SDS gel Buffer برای الکتروفورز آماده شدند.

تمام نمونه ها تا 100 درجه برای 5 دقیقه مستقیماً حرارت داده شدند قبل از الکتروفورز بعد از الکتروفروز ژن رنگ آمیزی گردید با کوماس برلیانت بلو و برای اتو رادیوگرافی استفاده شد.

درهر 3 گونه ترموفیل شوک حرارتی بطور واضح الگوی سنتز pro ها را تغییر داد(شکل2) این تغییر در الگوی pro ها شامل تغییر هم در تعداد pro ها و هم در شدت و درجه باندای visible بود.

در باسیلوس باندها با توده های مولکولی 19 39 54 60 و 67 و 78 kda بطور واضح از نظر شدت افزایش یافتند در حالی که شدت دیگر Pro ها کاهش یافت و در همان حد باقی ماند ( fig 2 A )، فقط رویت باند KDa 78 از نظر شدت کاهش یافت از دوره اول شوک ( 0 تا 5 دقیقه ) تا دوره دوم ( 5 تا 10 دقیقه ).

5 باند دیگر القا شده با حرارت نیز افزایش شدتشان را در طول هر 2 دوره شوک حفظ کردند ولی باند KDa 78 از نظر شدت روی ژل رنگ آمیزی شده با کوماسی برلیانت بلو شدتش افزایش یافت.

- در 2 گونه دیگر باسیلوس B.steavothermophilus , B.subtilis تقریباً 12 HSP شناسایی شدند و همان رنج از توده مولکولی را برای B.

caldolyticus مشاهده کردیم.

در این باسیل ها HSP اصلی وزن مولکولی 70 KDa را دارد.

- در S.Shibatae یک باند اصلی از تقریباً 55 KDa و 5 باند minor از 27 32 49 65 و 82 KDa مشاهده شدند ( شکل 2B ) این مشاهده مسلم گزارش کرد وجود یک Major pro 55 KDa و 2 Minor 28، 35 KDa در این ارگانیسم.

3 باند دیگر القاشده با حرارت 49 65 و 82 KDa نسبتاً خفیف نیز دیده شد.

ما متوجه شدیم که باند 55 KDa بطور قابل توجهی هم در شرایط نرمال و هم حرارت غلبه دارد.

گزارشات ثابت کرد که این باند 4 تا 6 برابر در طول یک دوره شرکت حرارتی 86 تا 88 درجه از نظر شدت افزایش می یابد و pro منسوب به کلاس 60 HSP از چاپرون های مولکولی است.

در T.

lannginosus کل 8 باند 31/32/33/57/65/78/100 و 110 KDa در طول اولین مرحله شوک شدتشان افزایش یافته در طول دوره دوم 31 و 32 و 33 kDa در شدت‌های افزایش‌ یافته در طول دوره دوم labeling (50 تا 40 min)باقی ماندند.

(شکل c2) تمام این باندها در محدوده مورد انتظار برایHSP های گزارش شده سایر قارچ‌ها هستند.

در دیگر قارچ‌های رشته‌ای MSP.

Neurospora Crassa 70 و 80و90 بیشتر القا می‌شوند البته این به محیط رشد نیز بستگی دارد.

lannginosus MSP های بزرگ فوراً القا می‌شدند پس از انتقال حرارتی اما گروه HSPهای Small بطور واضح در پاسخ شوک حرارتی در طول هر دوره labeling غلبه دارند.

سنتز HSPهای Small برای Dictyostelium discoideum و N.Crassa گزارش شده است.

(1) * ارتباط بین ترموتولورانس و سنتز pro : اثرات بازدارنده‌های سنتز pro روی توسعه ترموتولورانس در طول شوک حرارتی در B.caldolyticns و S.shilatae در شکل fig3 نشان داده شده است.

برای B.caldolyticns ؟

(200 mg/ml200) سنتز pro را در طول شوک حرارتی ممانعت می‌کند و افزایش بقا در رابطه با ترموتولورانس را از بین می‌برد.

برای S.shilatae آمینواسید آنالوگ azitidine در یک غلظت 5.0 Mm به سنتز pro عملکردی در طول شوک حرارتی آسیب می‌زند و ترموتولورانس را از بین می‌برد.

آزمایشات کنترل که در آن‌ها این معرف‌ها بعد از شوک حرارتی یا حرارت‌های نرمال اضافه شدند نشان داد که هیچ یک سمی نبودند و اگر بعد از شوک اضافه گردند ترموتولورانس بدست آمده دوباره مشاهده می‌گردد.

در S.shilatae تحت شرایط آزمایش‌ها azetidine به طور آشکاری سرعت تشکیل متیونین هم در دماهای نرمال و هم شوک حرارتی را کاهش داد.

این سنتز هیچ یک ازباندهای القا شده با حرارت توضیح داده شده در بالا را تحریک نکرد اگر چه به طور قابل ملاحظه‌ای تشکیل باندهای 53 و 60 kDa را در حرارت‌های نرمال افزایش می‌دهد و باعث می‌شود که باند اصلی القا شده با شوک حرارتی (55 KDa) نمایان شود.

اثرات سیکلوهگزامید روی ترموتولورانس در T.

lannginosus در table 1 نشان داده شده است.

حضور این ممانعت کننده در طول شوک حرارتی اساساً ترموتولورانس را کاهش می‌دهد.

تعداد condia زنده مانده در حرارت‌های کشنده تا 5 درصد کاهش یافت.

اگر چه برای این ارگانیسم حضور سیکلوهگزامید بعد از شوک حرارتی چنین اثری داشت و درصد حیات را به حدود نصف کاهش داد این عقیده وجود دارد که سنتز pro در حرارت‌های کشنده تحت تأثیر قرار می‌گیرد.

و وقتی سیکلوهگزامید حاضر باشد 44% کاهش در حیات مشاهده می‌گردد.

- در 3 گونه توموفیل مورد مطالعه مثل دیگر ارگانیسم‌ها قرار گرفتن در معرض حرارت‌های بالا توانایی آن‌ها را برای بقا در حرارت‌های کشنده افزایش می‌دهد که بدست آمدن این ترموتولورانس در رابطه با افزایش سنتز پروتئین‌های شوک حرارتی است و افزایش آن‌ها در سلول به وفور اگر ضروری نباشد ولی به نظر می‌رسد که برای بقا در حرارت‌های بالا در سلول بسیار مهم می‌باشد.

(1) * بررسی سنتز و بازچینی HSP ها توسط Borrelia burgdorferi : سنتز و بازچینی HSPها توسط اسپیروکت یاد شده که عامل بیماری لایم می‌باشد توسط رادیولی بلینگ از همه اسپیروکت‌ها و اسفروپلاست‌ها، مقایسه یک بعدی و 2 بعدی با الکتروفورز ژن‌ پلی ساکارید SDS و استفاده از ایمونوشیمی مورد مطالعه قرار گرفت.

به دنبال تغییر حرارت از 28 به 39 درجه هومولوگ KDA 72 , Dnak و 3 HSP دیگر 21 و 27 و 39 KDA از نظر مقداری 3 تا 15 برابر بین 2 تا 6 ساعت افزایش یافتند.

آزمایشات انقال عکس حرارت به پایین با انتقال اسپیروکت‌ها از 40 به 28 درجه ادامه یافت که نشان داد در 15 تا 30 دقیقه سنتز اغلب HSP های اصلی به سطوحی که در حالت عادی نگهداری اسپیروکت‌ها در حرارت‌های پائین مشاهده می‌شود برمی‌گردد.

اسفروپلاست‌های بورلیا بورگدورفری با در معرض گذاری با لایزوزیم و EDTA بدست آمده و سپس رادیو لی بل شدند و HSPهای خاص از نظر مکان در غشا یا سیتوپلاسم قرار داشتند.

آنالیز بیشتر با الکتروفورز 2 بعدی 3 ایزوفرم اصلی بیان شده Dnak با pis نزدیک 5.5 را نشان داد.

به دنبال کشف و بررسی شوک حرارتی یک الگو حاکی از تجزیه Dnak مشاهده شد اما نه در اسپیروکت‌هایی که در یک حرارت پایین قرار گرفتند.

برخی محصولات حاصل از تجزیه با آنتی بادی‌های مونوکلونال مستقیم در برابر پروتئین Dnak آزبورلیا شناسایی شدند.

این جزئیات پیشنهاد می‌کند که به دنبال یک دوره سنتز Dnak بطور فعال تجزیه می‌گردد بطوریکه باکتری فعالیت‌های گرماسنجی متابولیک‌اش را تجدید می‌کند.

و 10 تا 15 پلی پتپر بورلیا شامل DRAK یک اپی توپ معمول و رایج دارند.

بیماری ؟

که یک بی نظمی پیچیده در چند سیستم است که توسط اسپیروکت بورلیا که بوسیله کنه منتقل می‌گردد ایجاد می‌گردد.

در مرحله اولیه زخمهای پوستی و سپس در مراحل سیستمی ثانویه و مرحله سوم نشانه‌هایی مثل myocarditis و arthritis و ...

مشاهده می‌گردند.

مطالعات زیاد به فاکتورهای بورلیایی خاص که مسئول خسارت به بافت میزبان هستند و تصور می‌شود در ایجاد پاسخ خود ایمن به اسپیروکت نقش مهمی در واکنش بین میزبان و پاتوژن باز می‌کنند اشاره می‌کند.

این پاسخ‌ها ممکن است به علت قسمتی از پاسخ‌هایی باشد که به HSPهای باکتری داده می‌شود و به دنبال عفونت.

بخصوص وسط HSP هایی با وزن مولکولی شبیه بهم و بسیار حفاظت شده HSP اصلی بورلیا بورگدورفری 72 KDA هومونگ Dnak باعث واکنش ایمنی می‌گردد و از بیماران دارای لایم قابل شناسایی است.

هم چنین شباهت آنتی ژنیکیHSP های پاتوژن و میزبان هم ممکن است دخیل باشد.

بورلیا بورگدورفری دارای یک سیکل زندگی 2 فازی است.

OSPC از باکتری نشان داده شده است که بطور اختصاص در طول خون خوری کنه القا می‌گردد بطوری که سنتز OSPA کم می‌گردد که در تولید عفونت نقش دارد.

حیات باکتری در لاروهای کنه Ixodes ، تقویت عفونت کنه‌های باکتری در حرارت‌های بالا 275 درجه آن‌ها را برای موش غیر بیماریزا می‌کند.

HSP های اصلی در اغلب ارگانیسم‌ها از نظر سایز تقریباً در کلاس‌های 80 تا 90 و 68 تا 75 و 15 تا 30KDA قرار دارند.

یکی از بهترین این کلاس‌ها فامیل Dnak است.

(68 تا 75 KDA) این PRO چند فعالیت بیولوژیکی قابل توضیح دارند : آنها به عنوان چاپرون‌های مولکولی عمل می‌کنند، در رابطه با ثبوت pro ها و در اسمبلی pro ها که مربوط به فعالیت ATPASE است عمل می‌کنند.

Dnak همچنین تجزیه pro های دناتوره شده را توسط تشکیل کمپلکس‌های مخصوص شناسایی برای یک یا چند پروتئاز، بطور تیپیک lan یا CLP پروتئاز آسان می‌کند.

بررسی‌های نشان داده که Dnak برای تجزیه سریع یک Pro سوتانت توسط LA پروتئاز در اکولی نیاز است و نقش مهمی دارد.

چاپرون‌های GROEL و EROES همچنین در تجزه PROهای غیرطبیعی شرکت می‌کنند.

مطالعات ابتدایی فعالیت بیوشیمیایی Dnak از باکتری بورلیا را بررسی می‌کند و مطرح می‌کند که فعالیت چاپرونی محدود به pro 4 KDA فلاژین است.

اخیراً ژن‌ برای پروتئاز LAN یک HSP حودنی کلون شده است.

در این مطالعه رفتار پاسخ استرس حرارتی بورلیا ارزیابی شد.

هومورگ Dnak به سرعت با شوک حرارتی القا شد و به دنبال یک دوره پیک سنتز تجزیه گردید.

همچنین اسفروپلاست‌ها می‌توانند در مطالعه HSP ها مورد استفاده قرار می‌گیرند و به عنوان حد واسط عمل کنند بر پایه حدویت در تلاش برای تعیین مکان PROهای اسپیروکتی بخصوص در سیتوپلاسم و غشای داخلی.

(6) روش مورد استفاده : بطورخلاصه در دانشگاه کالیفرنیا بررسی‌هایی از سویه‌های HB19, B31 از بورلیت بورگدورفری انجام شد که سویه B31 از کنه و سویه HB19 از انسان جدا شد و از محیط BSK – II که دارای سرم گاوی بود استفاده گردید.

کشت BIS برای آنالیز پاسخ HSP و برای الکتروفورز SDS – PAGE استفاده شد.

سلول‌ها با سانتریفیوژ بدست آمدند و در محیط BSK II حل شدند وانکو به شدند و دوباره این سلول‌های نشان دار شده با سانتریفیوژ بدست آمدند.

3 بار در PBS (فسفات بافرسیلین) شسته شدند و در معرض حرارت قرار گرفتند و سنتز HSP ها با توجه به PRO لی بل شده اسپیروکتی با استفاده از آلتورادیوگرافی تعیین گردید.

میزان سنتز HSP تقریباً 15% از هر آزمایش به آزمایش مرحله بعد تغییر می‌کرد.

(6) سنتز HSPها به دنبال تغییر حرارت : در یک مرحله آزمایش اسپیروکت‌های کشت داده شده در 28 تا 34 درجه در یک مرحله‌ای از آزمایش به 40 درجه انتقال داده شدند و در مرحله دوم به حرارت‌های پایین منتقل شدند به 28 درجه یا در همان 40 درجه باقی مانند و تولید PRO بررسی گردید.

اسپیروکت‌ها به روش BUCK مطابق با روش‌های مورد استفاده برای ECOLI و سالمونلا تایفی موریوم استفاده می‌شود به اسفروپلاست تبدیل شدند.

در اینجا از محیط BSH II و TRIS MCL و ساکارز و لایروزیم و EATA و همچنین متیونین و سیستمئین نشان دار شده استفاده شد.

کینتیک سنتز HSP به دنبال شوک حرارتی : در مطالعه پاسخ حرارتی و تولید HSP ها در بورلیا بورگده فری در 15 دقیقه به دنبال یک تغییر از 28 تا 40 درجه سطح Drak افزایش یافت 7/2 برابر و محاسبه گردید که 1/7% سنتز pro به دنبال القا حرارت را در برمی‌گیرد.

(شکل 1) بین 30 دقیقه و 1 ساعت Drak حاصل میزان max 3/10 درصد از PRO نشان دار شده سلول، 4.3برابر بیشتر از سطح در 28 درجه.

(شکل) با ادامه labeling باکتری در 40درجه سطح pro کاهش یافت به میزان 3/5 درصد بعد از 4 ساعت و 7/4 درصد بعد از 6 ساعت.

وقتی اسپیروکت در 39 درجه برای 1 تا هفته کشت داده شد Drak در سطحی تقریباً 2 برابر مشاهده شده در 28 درجه نگاه داشته شد.

HSP 27 و 22 به میزان بالای Dnak حاضر نشدند و بعد از 2 ساعت میزانشان زیاد شد ولی در مقابل HSP 39به طور ضعیف القا شد (شکل 1 و 2) سنتز سایر PRO ها مثل OSP B , A و فلاژلین با حرارت القا نشد.

با کاهش حرارت از 40 به 28 درجه در مورد این باکتری تولید Dnak از 6/13% به 8/3 درصد از کلpro اسپیروکتی کاهش یافت.

(شکل 3 و4) در این آزمایش سنتز HSP 27 و 22 HSP نیز با کاهش حرارت کاهش یافت اگر چه این HSP ها 2 تا 3 برابر در 40درجه القا شدند (6) * تعیین مکان Dnak وpro حساس به ؟

29 KDA : 2PRO تنظیمی توسط حرارت در غشا و سیتوزون تمام اسپیروکت‌ها و اسفروپلاستها تعیین گردیدند.

Dnak در حرارت‌های بالا القا می‌شود (شکل 5 مقایسه لاین‌های 3 با 4) پروتئین 29 KDA در یک مطالعه‌زودتر مشاهده شد و در اسفروپلاستهای نشان دار شده در 28 درجه بخصوص در ناحیه سیتوپلاسمی به آسانی مشاهده گردید.

* الکتروفورز 2 بعدی و تشخیص HSP ها : HSP های HB 19 و B 31 با الکتروفورز 2 بعدی بیشتر قابل تشخیص هستند.

3 اینروفرم Dnak در یک PH حدود 5.5 نیز شناسایی شدند.

تمام ایزوفرم‌ها در حرارت کم حاضر شدند اگر چه اغلب گونه‌های اسیدی کمتر از دیگران برجسته بودند (شکل VA) یک مسئله جالب توجه تجزیه Dnak پس از 2 تا 3 ساعت شوک حرارتی بود.

در شکل 6b برای HB 19 و در شکل 6D برایB31 نشان داده شده به علاوه HSP هایminor با PSI بین 5 تا 8 شامل PRO های 60 39 36 18 22 و 14 KDA با الکتروفورز 2 بعدی آشکار شدند.

(شکل 6D) PI پایه از HSP KDA39 در مقایسه دقیق با آنچه که برای PRO Dnaj از اکولی بود شناسایی شد.

* بحث و نتیجه گیری از این بررسی : در این جا نیز استرس گرمایی به سرعت سنتز HSP ها را در باکتری القا می‌کند.

ژن‌هایی برای یک تعدادی از هومولوگ‌های HSP بورلیا بورگدورفری شامل GroEL 60 KDa , Dnak ، KDa 39 Dnaj و kDa21 Grptz کلون شده‌اند.

فعالیتهای بیوشیمیایی این محصولات ژنی در اکولی بخصوص توضیح داده شده است.

یک اختلاف مشاهده شده : موتاث‌های grpe , dnaj از اکولی با هومولوگهای بورلیا کامل‌ می‌شوند.

حال آنکه یک Dnak موتانت از Ecoli اینگونه نیست.

در این بررسی نشان داده شد 4 HSP اصلی از بورلیا بورگدورفری در انتقال حرارت به بالا 1 تا 2 ساعت پس از شوک حرارتی در سطوح بالایی بدست آمدند.

(شکل 1 و 2) سطح HSP غالب Dnak در اولین ساعت پس از انتقال به حرارت بالا افزایش یافت ولی سپس کاهش یافت، نسبت به کل pro سلولی اگر چه هنوز پس از 6 ساعت مورد توجه بود.

هم چنین سنتز دیگر pro نیز با افزایش حرارت القا گردید.

سطح 22 HSP ، GRpE و یا هومولوگ Lon 4 تا 5 برابر افزایش یافت.

39 HSP به احتمال زیاد هومولوگ Dnaj و 27 HSP 2 تا 4 برابر القا شد.

به علاوه SDS- PAGE 2 بعدی و آتورادیوگرافی (شکل 6D) نشان داد که PROهای36 و 42 و 62 KDA (احتمالاً هومولوگ Grotel ) با حرارت تنظیم می‌شوند.

آزمایشات طراحی شده برای نشان دادن سنتز HSP در طول حصول از شوک حرارتی یک کاهش تولید Dnak در طول 4 ساعت اولیه را نشان داد.

(شکل 4) در مقابل سنتز HSP 27 و 22 در همان دوره تغییر نیافت.

این مطالعات نشان داد که افزایش در سنتز HSP های اصلی در این باکتری در پاسخ به شوک حرارتی اتفاق می‌افتد.

مطالعات شامل کشت بورلیا برای 2 هفته در 28 و 38 درجه نشان داد که Dnak در یک سطح 2 تا 3بار بزرگتر از حرارت پایین باقی می‌ماند.

اگر چه ادامه کشت در 38 درجه کاهش حرکت در باکتری و pro های سطحی را به دنبال دارد.

مطالعات نشان داد که در اکولی تولید موتانت Dnak در حرارت 34 درجه یا بالاتر باعث فیلا؟

شدن می‌شود ولی اگر su1A HSP که در پاسخ به خسارتDna تولید می‌گردد تجزیه نگردد.

سلول فیلامنشی شده و می‌میرد.

(6) شاید فرم‌هایی از باکتری که در چند مرحله انتقال تحت شرایط شوک حرارتی حاصل می‌شود به علت تغییر درتوانایی Dnak و تجزیه پروتئولایتیک و proهای دناتوره شده باشد که می‌تواند به علت اثرات پروتئاز LON باشد.

انواع میکروارگانیسم‌ها و سلول‌های یوکاریوتی در انتقال حرارت‌های کشنده، اگر درآغاز در معرض یک حراست ساب لتال قرار گیرند توانایی حیات دارند.

بطور معمول 5 تا 15 دقیقه یک شوک حرارتی معمول نیاز است برای حصول و القا این مرحله از ترموتولورانس .

این اسپیروکت هنوز در نشان دادن و ایجاد پاسخ شوک حرارتی بالای 40 درجه ناتوان است و می‌میرد.

این عدم توانایی به آسانی قابل توضیح نمی‌باشد زیرا که نشان داده شده اسباب و لوازم شوک حرارتی در باکتری حاضر هستند.

به هر حال این باکتری بطور فندیولوژیکی به عنوان یک پاسخ دهنده باواسطه در شرایط شوک حرارتی رفتار می‌کند.

در مکانی بین ECOLI واکنش دهنده که به آسانی ترموتولورانس را ایجاد می‌جند و ترپونما پالیدوم غیر واکنش دهنده که شدیداً حساس به حرارت است و بی نظیر در شکستش در ایجاد یک پاسخ خوب حرارتی قابل اندازه‌گیری.

Dnak اغلب به طور جزئی محلول با استفاده از کشت باکتری در 33 یا 37درجه حاصل شده است اگر چه وقتی b در 20 درجه کشت شود Dnak در یک میزان جزئی غشایی در triton x – loo پیدا می‌شود.

و به نظرمی‌رسد که Dnak از نظر موقعیت در رابطه با سیتوپلاسم می‌باشد هم در حراست‌های نرمال و هم زیادو پیش بینی می‌شود که تبدیل باکتری به اسفروپلاست یک پدیده‌ای است که تحت تأثیر فشار ایجاد می‌گردد و ممکنه نتیجه القا شوک حرارتی باشد که تمرکز Dnak را دگرگون می‌کند.