مقدمه جنس یرسینیا با پذیرفتن نام‌های متعددی چون فلاوباکتریوم پسودومولئی، باکتریوم انتروکلی تیکا، پاستور لاپسودوتوبرکلوزیس، پاستور X و ژرم X نهایتا از سال 1974 از خانواده پاستور لاسه جدا و به همراه سه گونه اصلی یرسینیاپستیس، یرسینیا پسودوتوبرکلوزیس و یرسینیا انتروکلی تیکا بطور قطعی در خانواده آنتروباکتریا سه جای گرفت.
این باکتریها از جمله بیماری زاهای مشترک انسان و دام هستند و مهم ترین گونه‌ای که نقش آن در بیماری زایی انسان از سال 1965 به اثبات رسیده است یرسینیا انتروکلی تیکا می‌باشد، شیر خام، گوشت، سبزیجات و آب می‌تواند بعنوان منبع آلودگی این باکتری مطرح باشد.
یرسینیا انتروکلی تیکا می‌تواند عامل بیماری معدی روده‌ای، آدنیت مزانتریک، اریتم گره‌دار عفونت خونی و پلی آرتریت باشد.
این ارگانیسم، کوکو باسیلی است گرم منفی، بدون کپسول، بی‌هوازی اختیاری بطول 1-3 میکرومتر و عرض 0/5 - 0/8 میکرومتر که حرکت آن فقط در دمای پائین تر از 30 درجه سلسیوس به کمک فلاژل‌های پیرامونی صورت می‌گیرد.
دمای مناسب رشد آن 28-29 درجه سلسیوس PH مناسب آن 7/2 - 7/4 است و مانند اکثر آنتروباکتریاسه‌ها گلوکز را بدون گاز تخمیر میکند و اکسیداز منفی است.
سروتیپ‌های جدیدی چون 0:13a; 13b, 0:4,32, 0:5,27, 0:21 بیماری‌زا تشخیص داده شده‌اند.
بیشترین سروتیپ‌های بیماری‌زا 0:3 0:8, 0:9 می‌باشد.
از نظر سرولوژی آگلوتیناسیون‌های متقاطع با ارگانیسم‌هایی مانند سالمونلا، بروسلا، شیگلا، اشری شیاکلی و ویبربو گزارش شده است.
1 هدف و دامنه کاربرد هدف از تدوین این استاندارد ارائه روش جداسازی و شناسایی یرسینیا انتروکلی تیکای بیماری زا برای انسان است .
این روش در مورد فرآوردههای غذایی انسان و دام کاربرد دارد .
2 واژهها و تعاریف در این استاندارد واژهها با تعاریف زیر بکار میروند : هدف از تدوین این استاندارد ارائه روش جداسازی و شناسایی یرسینیا انتروکلی تیکای بیماری زا برای انسان است .
2 واژهها و تعاریف در این استاندارد واژهها با تعاریف زیر بکار میروند : 2 1 یرسینیا آنتروکلی تیکای بیماری زا باکتریهای سرما گرایی هستند که اگر طبق روش مشروح در این استاندارد آزمایش شوند روی محیط های جامد انتخابی پرگنههای ویژهای ایجاد مینمایند که از نظر خواص بیوشیمیایی با معیارهایی بیماری زائی این استاندارد مطابقت میکند .
در این استاندارد واژهها با تعاریف زیر بکار میروند : 2 1 یرسینیا آنتروکلی تیکای بیماری زا باکتریهای سرما گرایی هستند که اگر طبق روش مشروح در این استاندارد آزمایش شوند روی محیط های جامد انتخابی پرگنههای ویژهای ایجاد مینمایند که از نظر خواص بیوشیمیایی با معیارهایی بیماری زائی این استاندارد مطابقت میکند .
2 2 شناسایی یرسینیا آنتروکلی تیکا شامل حضور یا عدم حضور این باکتری در مقدار معینی از فرآورده غذایی است که بر طبق روش مشروح در این استاندارد تعیین میشود .
3 اساس آزمایش شناسایی یرسینیا آنتروکلی تیکای احتمالا بیماری زا در طی سه مرحله پی در پی زیر صورت می‌گیرد .
3 1 غنی سازی در محیط مایع انتخابی 3 1 1 کشت نمونه مورد آزمون در دو محیط غنی کننده زیر : شناسایی یرسینیا آنتروکلی تیکای احتمالا بیماری زا در طی سه مرحله پی در پی زیر صورت می‌گیرد .
3 1 غنی سازی در محیط مایع انتخابی 3 1 1 کشت نمونه مورد آزمون در دو محیط غنی کننده زیر : الف آبگوشت نمک های صفراوی و سوربیتول و پپتن Peptone Sorbitol and Bile salts Broth (PSB ) ب : آبگوشت ایرگازان تیکارسیلین وکلرات پتاسیم Jrgasan ticarcillin and Potassium chlorate broth (ITC) 3 1 2 گرمخانه گذاری کشت (PSB) در دمای 25 22 درجه سلسیوس بمدت 3 تا 5 روز کشت (ITC) در دمای 25 22 درجه سلسیوس بمدت 2 روز (48 ساعت ) 3 2 کشت در محیطهای جامد کشت سطحی از محیطهای PSB.ITC بترتیب در محیطهای جامد زیر : 3 2 1 محیط سفسولودین ایرگازان و نووبیوسین آگار Cefsulodin Irgasan and novobiocin agar (CIN) 3 2 2 محیط سالمونلا شیگلا آگار حای ذرکسی کلات سدیم و کلرور کلسیم Salmonella / Shigella agar with Sodium desoxychlate and Calcium chloride (SSDC) 3 2 3 گرمخانه گذاری محیطهای CIn و SSDC در دمای 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
پس از 24 ساعت و در صورت لزوم پس از 48 ساعت متناسب با محیط , کشت ها را به منظور حضور پرگنه های ویژه یرسینیا آنتروکلی تیکا بررسی کنید .
3 3 تایید در این مرحله روی پرگنههای مشکوک به یرسینیا آزمایشهای بیوشیمیایی , آزمایش های خاص منطبق با معیارهای بیماری زایی و در صورت امکان آزمایش های سرولوژیکی برای تایید انجام میشود .
به راهنمای روش کار مراجعه شود .
4 ـ محیطهای کشت ومعرف های لازم 4 ـ 1 ـ کلیات بدلیل تعداد زیاد محیطهای کشت و معرفها و برای وضوح شرح آزمایش , ترکیبات محیطها , جزییات مربوط به تقسیم و نگهداری آنها به صورت پیوست در استاندارد آمده است .
4 ـ 2 ـ محیطهای غنی کننده 4 ـ 1 ـ کلیات بدلیل تعداد زیاد محیطهای کشت و معرفها و برای وضوح شرح آزمایش , ترکیبات محیطها , جزییات مربوط به تقسیم و نگهداری آنها به صورت پیوست در استاندارد آمده است .
4 ـ 2 ـ محیطهای غنی کننده 4 ـ 2 ـ 1 ـ محیط مایع حاوی پیتن , سوربیتول و نمکهای صفرا (PSB) 4 ـ 2 ـ 2 محیط مایع حاوی ایرگازان ـ تیکارسیلین وکلرات پتاسیم (ITC) 4 ـ 3 ـ محیطهای کشت 4 ـ 3 ـ 1 ـ سفسولودین ـ ایرگازان و نووبیوسین حاوی آگار (CIN) 4 ـ 3 ـ 2 ـ سالمونلا ـ شیگلا آگار حاوی ذرکسی کلات سدیم و کلرور سدیم (SSDC) 4 ـ 3 ـ 3 ـ نوترنیت آگار 4 ـ 4 ـ محیط های شناسایی ومعرفها 4 ـ 4 ـ 1 ـ محیط کشت اوره تریپتوفان 4 ـ 4 ـ 2 ـ معرف شناسایی تریپتوفان دی آمیناز 4 ـ 4 ـ 3 ـ کلیگر آگار 4 ـ 4 ـ 4 ـ معرف تشخیص اکسیداز 4 ـ 4 ـ 5 ـ محیط های کشت دکربوکسیلاز 4 ـ 4 ـ 5 ـ 1 ـ محیط کشت لایزین دکربوکسیلاز 4 ـ 4 ـ 5 ـ 2 ـ محیط کشت اورنی تین دکربوکسیلاز 4 ـ 4 ـ 6 ـ محیط برای تخمیر قندها ( ساکارز ( رامنوز یا سالیسین ) 4 ـ 4 ـ 7 ـ محیط سیمون سیترات 4 ـ 4 ـ 8 ـمحیط صفرا و اسکولین آگاردار 4 ـ 4 ـ 9 کازئین سویا اگاردار 4 ـ 4 ـ 10 ـ کارتین سویا آگار دار برای شناسایی آمیداز 4 ـ 4 ـ 11 ـ محلول سولفات آمونیوم و آهن دو ظرفیتی برای شناسایی پیرازین آمیداز مازئین سویا آگاردار حاوی منیزیم وآگزالات 4 ـ 5 ـ سرم فیزیولوژی 4 ـ 6 ـ پتاسیم هیدروکساید در سرم فیزیولوژی 4 ـ 7 ـ محیط SIM آگار 5 ـ وسایل ضروری یادآوری : بجای ظرف شیشهای چند بار مصرف از وسایل یکبار مصرف بشرط دارابودن ویژگیهای مناسب میتوان استفاده کرد.
.
5 ـ 1 ـ وسیله سترون کردن خشک ( آون ) یا سترون کردن مرطوب ( اتوکلاو ) 5 ـ 2 ـ گرمخانه قابل تنظیم در 22±1درجه سلسیوس و 25±1درجه سلسیوس.
یادآوری : بجای ظرف شیشهای چند بار مصرف از وسایل یکبار مصرف بشرط دارابودن ویژگیهای مناسب میتوان استفاده کرد.
5 ـ 3 ـ قفسه خشک کردن یا آون دارای تهویه هوا با جابجایی و قابل تنظیم در 37±1 درجه و 55±1 درجه سلسیوس 5 ـ 4 ـ حمام آب قابل تنظیم در دمای 45±0/5درجه سلسیوس و 50±0/5درجه سلسیوس 5 ـ 5 ـ لولههای آزمون با ابعاد 180*18 و 180*9 و 50*12 میلی متر 5 ـ 6 ـ ظروف شیشه ای و بطری های با گنجایش مناسب 5 ـ 7 ـ ظروف پتری شیشهای یا پلاستیکی بقطر 100 ـ 90 میلی متر 5 ـ 8 ـ پی پتهای 1 و 10 میلی لیتری با درجه بندی 0/1 میلی لیتر 5 ـ 9 ـ مکندههای لاستیگی ( پوآر ) مخصوص پی پت 5 ـ 10 ـ حلقه کشت بقطر تقریبی 3 میلی متر و سوزن کشت سر صاف از جنس پلاتین / ایریدوم یا نیکل / کروم و یا پی پت پاستور شیشهای بجای سوزن کشت .
یادآوری : حلقه و سوزن کشت یکبار مصرف می‌تواند استفاده شود حلقه کشت از جنس نیکل / کرم برای انجام آزمون اکسیداز مناسب نیست .
5 ـ 11 ـ PH متر بادقت ±0/1 واحد PH در 25 درجه سلسیوس 5 ـ 12 ـ منبع نور مناسب برای تابش مورب 5 ـ 13 ـ ذره بین یا میکروسکوپ 5 ـ 14 ـ مخلوط کن ( استوماکر ) 6 ـ نمونه برداری نمونه برداری از فرآورده باید با رعایت اصول مربوط به نمونه برداری فرآورده غذایی برای آزمایشهای میکربی صورت گیرد .
نمونهای که به آزمایشگاه میرسد باید معرف واقعی کالا بوده و در حین نمونه برداری و حمل و نقل دچار آسیب دیدگی و تغییر نشده باشد .
7 ـ آماده کردن نمونه نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملی شماره 356 ایران (( آماده کردن نمونه غذایی و تهیه رقم اعشاری نمونه برای آزمایش های میکربی )) آماده شود .
نمونه برداری از فرآورده باید با رعایت اصول مربوط به نمونه برداری فرآورده غذایی برای آزمایشهای میکربی صورت گیرد .
8 ـ روش آزمایش 8 ـ 1 ـ سوسپانسیونهای اولیه نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملی شماره 356 ایران (( آماده کردن نمونه غذایی و تهیه رقم اعشاری نمونه برای آزمایش های میکربی )) آماده شود .
8 ـ روش آزمایش 8 ـ 1 ـ سوسپانسیونهای اولیه 8 ـ 1 ـ 1 ـ مقدار معینی ( وزن ی حجم نمونه ) از نمونه مورد آزمایش را به حجم مشخصی از محیط PSB منتقل کنید بطوری که رقت یکدهم وزن به حجم یا حجم به حجم بدست آید و بعد با استوماکر آن را مخلوط کنید تا یکنواخت شود .
8 ـ 1 ـ 2 سوسپانسیون دیگری از نمونه , با محیط ITC با رقت وزن به حجم یا حجم به حجم تهیه کنید .
8 ـ 1 ـ سوسپانسیونهای اولیه 8 ـ 1 ـ 1 ـ مقدار معینی ( وزن ی حجم نمونه ) از نمونه مورد آزمایش را به حجم مشخصی از محیط PSB منتقل کنید بطوری که رقت یکدهم وزن به حجم یا حجم به حجم بدست آید و بعد با استوماکر آن را مخلوط کنید تا یکنواخت شود .
8 ـ 2 ـ غنی سازی 1 8 ـ 2 ـ 1 ـ محیط PSB کشت شده را در 25 ـ 22 درجه سلسیوس بمدت 5 روز بدون هم زدن و 2 تا 3 روز با هم زدن قرار دهید .
8 ـ 2 ـ 2 ـ محیط ITC کشت شده را در 25 درجه سلسیوس برای 2 ورز (48 ساعت ) گرمخانه گذاری کنید .
8 ـ 3 ـ کشت 8 ـ 3 ـ 1 ـ با حلقه کشت از محیط (PSB) بردارید و روی محیط جامد (CIN) طوری کشت دهید که پرگنه های مجزا حاصل شود .
8 ـ 3 ـ 2 ـ با پی پت سترون , 0/5 میلی لیتر از کشت PSB را به 4/5 میلی لیتر محلول پتاسیم هیدروکساید ( محیط شماره 20 پیوست ) بیفزایید و خوب مخلوط کنید و بعد از 20 ثانیه با حلقه کشت از ان بردارید و در سطح محیط (CIN) طوری کشت دهید که پرگنههای مجزا حاصل شود .
8 ـ 3 ـ 3 ـ با حلقه کشت از ITC کشت شده بردارید و در سطح جامد SSDC برای حصول پرگنههای مجزا کشت دهید .
8 ـ 3 ـ 4 ـ ظروف پتری بندهای 8 ـ 3 ـ 1 و 8 ـ 3 ـ 2 ـ و 8 ـ 3 ـ 3 را بطور وارونه در گرمخانه در دمای 30 درجه سلسیوس برای 24 ساعت قرار دهید .
8 ـ 3 ـ 5 ـ ظروف پتری را از گرمخانه خارج و آنها را به منظور شناسایی پرگنه های ویژه یرسینیا آنتروکلی تیکا در نور مایل (45 درجه ) با ذره بین بررسی کنید .
الف - پرگنه های یرسینیا آنتروکلی تیکا در محیط CIN کوچک ( برابر یا کوچکتر از یک میلی متر ) صاف یا مرکز قرمز و حاشیه شفاف و در زیر نور مایل با ظاهری گرانول دار ریز و بدون قوس و قزح است .
ب - پرگنههای یرسینیا آنتروکلی تیکا در محیط SSDC کوچک ( برابر یا کوچکتر از یک میلی متر ) خاکستری رنک یا حاشیه نامشخص و در زیر نور مایل با ظاهری دانه دار و ریز و بدون قوس و قزح است 8 ـ 3 ـ 6 ـ اگر پرگنه های یرسینیاریز و یا کمرنگ باشند و یا دیده نشوند ظروف پتری را برای 24 ساعت دیگر گرمخانه گذاری کنید .
8 ـ 3 ـ 7 ـ انتخاب پرگنهها از هر ظرف پتری هر یک از محیطهای انتخابی بند 8 ـ 3 ـ 1 و 8 ـ 3 ـ 2 و 8 ـ 3 ـ 3, 5 پرگنه مشکوک بردارید .
اگر در یک ظرف 5 پرگنه مشکوک یا کمتر وجود داشت تمام آنها را برای تایید بردارید .
8 ـ 3 ـ 8 ـ جدا سازی پرگنهها پرگنههای انتخاب شده را روی محیط نوتر نیت آگار ( محیط شماره 5 پیوست ) کشت خطی دهید و سپس ظروف پتری را برای 24 ساعت و در 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
پس از این مدت ظروف از گرمخانه خارج و آنها را در دمای ( 5 ـ 0) درجه سلسیوس ( دمای یخچال ) برای آزمایشهای تاییدی و بیماری زایی نگهداری کنید .
9 ـ آزمایش های بیو شیمیایی از کشت های خالص برای آزمایش های زیر استفاده میشود .
9 ـ 1 ـ آزمایش های تشخیص بیو شیمیایی 9 ـ 1 ـ 1 ـ آزمایش اوره از از کشت های خالص برای آزمایش های زیر استفاده میشود .
9 ـ 1 ـ آزمایش های تشخیص بیو شیمیایی 9 ـ 1 ـ 1 ـ آزمایش اوره از با میله شیشهای یا سوزن کشت از پرگنههای مجزا شده در محیط نوترنیت آگار برداریدو بطور دقیق زیر محیط مایع اوره ترپیتوفان ( محیط شماره 6 پیوست ) کشت دهید و برای 24 ساعت در دمای 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
نتیجه ـ رنگ صورتی بنفش نشان دهنده واکنش مثبت اوره آز است .
رنگ زرد نارنجی نشان دهنده واکنش اوره از است .
9 ـ 1 ـ 2 ـ آزمایش تریپتوفان دی آمیناز سه قطره ازمعرف شناسایی تریپتوفان دی آمیناز ( شماره 7 پیوست ) را به کشت حاصل از بند 9 ـ 1 ـ 1 بیفزایید .
نتیجه : رنگ قهوهای نشان دهنده واکنش مثبت است .
9 ـ 1 ـ 3 ـ کلیگلر آگار از پرگنههای خالص شده روی نوترینت آگار برداشته و در سطح محیط مورب کلیگلر آگار ( شماره 8 پیوست ) بطور خطی کشت دهید و بعد سوزن را به عمق محیط فرو برید .
سپس آن را در دمای 30 درجه سلسیوس برای 24 ساعت تا 48 ساعت گرمخانه گذاری کنید و .
سپس تغییرات حاصله در محیط را بشرح زیر مورد بررسی قرار دهید و نتیجهگیری کنید .
9 ـ 1 ـ 4 آزمایش اکسیداز با میله شیشهای قسمتی از پرگنه مجزا و خالص یرسینیا را بردارید و روی یک کاغذ صافی مرطوب شده با معرف اکسیداز ( شماره 9 پیوست ) یا روی دیسک قابل دسترس تجارتی تماس دهید ( از سوزن کشت یا حلقه کشت نیکل / کروم برای این منظور استفاده نشود).
نتیجه : چنانچه رنگ کاغذ صافی در مدت 10 ثانیه ارغوانی روشن , بنفش و یا آبی تیره نشود آزمایش اکسیداز منفی است .
توجه ـ علاوه بر آزمایشهای بیوشیمیایی فوق از آزمون حرکت نیز جهت تشخیص یرسینیا میتوان استفاده کرد .
9 ـ 1 ـ 5 ـ آزمایش حرکت از پرگنه های مجزا و خالص یریسنیا بردارید و بطور عمودی در دو لوله محتوی محیط SIM آگار ( شماره 21 پیوست ) فرو برید و یکی از دو لوله را در 25 درجه و دیگری را در 37 درجه سلسیوس برای 24 ساعت گرمخانه گذاری کنید و پس از این مدت آنها را بررسی کنید .
نتیجه : در صورتی که باکتری در محیط کشت به طرفین انتشار یافته باشد و کدورت در آن منطقه حاصل شده باشد آزمایش حرکت مثبت است .
9 ـ 1 ـ 6 ـ انتخاب پرگنهها پرگنه هایی که خصوصیات مندرج در جدول شماره یک را دارا هستند برای آزمایشهای تاییدی انتخاب شوند .
(1) – سویه های اوره آز منفی از یرسینیا انتروکلی تیکا گزارش شده اند که بیماری زا نیستند .
(2) – در موقع تشکیل گاز از گلوکز ممکن است کمی حباب هوا ایجاد شود اگر چه یرسینیا معمولا قندها را بدون ایجاد گاز تخمیر میکند ولی بعضی از سویه های یرسینیا ( بیووار 3 ) ممکن است یک یا دو حباب ایجاد کند ( ایجاد گاز ضعیف ) (3) – برخی از سویه های یرسینیا انتروکلی تیکا لاکتوز + از فراوره های لبنی جدا شده اند که معمولا بیماری زا نیستند .
9 ـ 2 ـ آزمایشهای تاییدی بیوشیمیایی 9 ـ 2 ـ 1 ـ آزمایش لایزین دکربوکسیلاز با سوزن با حلقه کشت یا میله شیشهای از پرگنه هایی مجزا و خالص شده روی نوترنیت آگار بردارید و در محیط لایزین دکربوکسیلاز ( شماره 10 پیوست ) کشت دهید و برای 24 ساعت در 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
نتیجه : پیدایش رنگ بنفش در محیط پس از گرمخانه گذاری نشان دهنده واکنش مثبت است و پیدایش رنگ زرد در محیط پس از گرمخانه گذاری نشان دهنده واکنش منفی است .
9 ـ 2 ـ 2 ـ آزمایش اورنی تین دکربوکسیلاز از پرگنههای خالص بردارید و در محیط اورنی تین ( شماره 11 پیوست ) کشت دهید و 24 ساعت در 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
نتیجه : پیدایش رنگ بنفش پس از گرمخانه گذاری نشان دهنده واکنش مثبت است و پیدایش رنگ زرد در محیط پس از گرمخانه گذاری نشان دهنده واکنش منفی است .
9 ـ 2 ـ 3 ـ تخمیر ساکارز و رامنوز از پرگنه هیا خالص بردارید و در محیطهای قندی مایع ( شماره 12 پیوست ) کشت دهید و برای 24 ساعت در 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
نتیجه : پیدایش رنگ زرد پس از گرمخانه گذاری نشان دهنده واکنش مثبت است و پیدایش رنگ قرمز پس ازگرمخانه گذاری نشان دهنده واکنش منفی است .
9 ـ 2 ـ 4 ـ هیدرولیز سیترات از پرگنههای خالص یرسینیا بردارید و در سطح مورب محیط سیمون سیترات ( شماره 13 پیوست ) کشت دهید و آن را برای 24 ساعت در 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
نتیجه : پیدایش رنگ آبی در محیط پس از گرمخانه گذاری نشان دهنده واکنش مثبت است و اگر در محیط تغییر رنگ ایجاد نشود هیدرولیز سیترات منفی است .
9 ـ 3 ـ آزمایشهای تاییدی بیماری زائی 9 ـ 3 ـ 1 ـ انتخاب پرگنه از پرگنه هایی که دارای خصوصیات مندرج در جدول شماره 2 میباشند برای انجام آزمایش های بیماری زایی استفاده کنید .
– سویه یرسینیا انتروکلی تیکا بیووار 5 اورنی تین گزارش شده است .
2 – برخی از سویه های نادر یرسینیا انتروکلی تیکای بیماری زا ساکارز منفی از خوک جدا شده است .
9 ـ 3 ـ 2 ـ تخمیر سالیسین با سوزن یا حلقه کشت و یا میلهای شیشهای , از پرگنههای مجزا و خالص رشد کرده در محیط نوترنیت آگار که خصوصیات مندرج در جدول شماره 2 را دارند بردارید و در زیر محیط مایع مخصوص تخمیر قند سالیسین ( شماره 12 پیوست ) کشت دهید و آن را برای مدت 24 ساعت در 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
نتیجه : ظهور رنگ زرد پس از گرمخانه گذاری واکنش مثبت را نشان میدهد و ظهور رنگ قرمز پس از گرمخانه گذاری واکنش منفی را نشان میدهد .
9 ـ 3 ـ 3 ـ تخمیر اسکولین با سوزن با حلقه کشت یا میلهای شیشهای , از پرگنههای مجزا و خالص رشد کرده در محیط نوترنیت آگار که خصوصیات مندرج در جدول شماره 2 را دارند بردارید و در سطح مورب محیط جامد اسکولین و صفرا ( شماره 14 پیوست ) کشت دهید و آن را برای مدت 24 ساعت در 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
نتیجه : هاله سیاه دراطراف پرگنهها مثبت را نشان میدهد .
9 ـ 3 ـ 4 ـ پیرازین آمیداز از پرگنههای مجزا و خالص روی نوترنیت آگار که خصوصیات جدول شماره 2 را دارا میباشند بردارید و سطح وسیعی از محیط مورب سویا آگار ( شماره 16 پیوست ) را کشت کنید و برای 48 ساعت در 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
پس از اتمام گرمخانه گذاری , یک میلی لیتر محلول سولفات 2 ظرفیتی آهن و آمونیوم ( شماره 17 پیوست ) به آن بیفزایید .
نتیجه : ظهور رنگ قهوهای مایل به صورتی آزمایش مثبت را نشان میدهد .
9 ـ 3 ـ 5 ـ نیاز به کلسیم در 37 درجه سلسیوس 9 ـ 3 ـ 5 ـ 1 ـ بخش کوچکی از پرگنههای مجزا و خالص روی نوترنیت آگار را که خصوصیات جدول شماره 2 را دارا میباشند بردارید ومحلول سرم فیزیولوژی ( شماره 19 پیوست ) مخلوط کنید ( سوسپانسیون تقریبی 103 باکتری در میلی لیتر ) سپس هر یک از ظروف پتری زیر را بطور جداگانه , با یکدهم میلی لیتراز سوسپانسیون آماده شده کشت دهید .
9 ـ 3 ـ 5 ـ 1 ـ الف ـ 2 ظرف پتری حاوی کازئین سویا آگار ( شماره 15 پیوست ) بعنوان مرجع 9 ـ 3 ـ 5 ـ 1 ـ ب ـ 2 ظرف پتری حاوی کازئین سویا آگار با منیزیم و اکسالات ( شماره 18 پیوست ) یک ظرف کشت شده از 9 ـ5-3 ـ 1 ـ الف و یک ظرف از 9 ـ 3 ـ 5 ـ 1 ـ ب را برای 48 ساعت در 37 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
نتیجه : اگر پس از این مدت , در محیط کازئین سویا در هر دو درجه (25 و 37 درجه سلسیوس ) پرگنه هایی با اندازه یکنواخت رشد کنند و در محیط کازئین سویا با منیزیم و اکسالات فقط پرگنهها در 25 درجه رشد یکنواخت داشته باشند و در 37 درجه رشد پرگنهها غیر یکنواخت باشد ( کوچک و بزرگ ) بشرطی که پرگنههای کوچک بیش از 20 درصد کل پرگنهها را تشکیل میدهد واکنش مثبت است یعنی سویههای فوق نیاز به کلسیم دارند و بیماری زا هستند .
9 ـ 3 ـ 5 ـ 2 ـ برای تشخیص بیماری زایی میتوان از روش زیر استفاده کرد .
از سوسپانسیون آماده شده طبق بند 9 ـ 3 ـ 5 ـ 1 استفاده کنید و هر یک از محیطهای زیر رابطور جداگانه با 0/1 میلی لیتر از سوسپانسیون آماده شده کشت دهید .
الف - دو ظرف پتری حاوی محیط آگار خون دار پایه ( شماره 22 پیوست ) ب - دو ظرف پتری حاوی محیط آگار خون دار پایه فوق حاوی 5/05 گرم در لیتر کلسیم .
یک ظرف پتری حاوی محیط کلسیم دار و بدون کلسیم را در 37 درجه سلسیوس و همچنین یک ظرف پتری حاوی محیط کلسیم دار و یک ظرف بدون کلسیم را در 25 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
و پس از 48 ساعت آنها را از گرمخانه خارج و مورد بررسی قرار دهید .
نتیجه : در محیط دارای کلسیم ( در 25 درجه و 37 درجه ) پرگنههای درشت یکنواخت رشد میکنند و در محیط فاقد کلسیم در 25 درجه سلسیوس پرگنه هایی درشت یکنواخت دیده میشود ولی در 37 درجه سلسیوس تعداد زیادی پرگنه ریز دیده میشود .
که نشان دهنده نیاز به کلسیم در 37 درجه و بیماری زائی است .
10 ـ تفسیر آزمایشهای بیوشیمیایی و بیماری زایی سویههای یرسینیا آنتروکلی تیکای بیماری زا عمومأدارای واکنشهای مندرج در جدول شماره سه میباشند .
یادآوری : از نقطه نظر همهگیری , مشخص کردن آنتی ژنهای سوماتیک یرسینیا حائز اهمیت است .
سویه هایی که احتمالا بیماری زا هستند با آنتی سرمهای 3:O, 8:O, 9:O, 5/27:O و 10:O مورد بررسی قرار گیرند .
نتیجه گیری بر اساس نتایج حاصل از جدول شماره 3 حضور یا عدم حضور یرسینیا آنتروکلی تیکای احتمالا بیماری زا در X گرم از فرآورده شناسایی کنید .-11 گزارش آزمونگزارش آزمایش باید حاوی اطلاعات زیر باشد.
بر اساس نتایج حاصل از جدول شماره 3 حضور یا عدم حضور یرسینیا آنتروکلی تیکای احتمالا بیماری زا در X گرم از فرآورده شناسایی کنید .
-11 گزارش آزمون گزارش آزمایش باید حاوی اطلاعات زیر باشد.
1-11 روش آزمون و دمای گرمخانه گذاری بکار رفته 2-11 نتایج بدست آمده از آزمایش 3-11 جزئیات اعمالی که در این استاندارد مشخص نشده ولی بطور اختیاری انجام گرفته است 4-11 هراتفاقی که ممکن است روی نتایج آزمایش اثر بگذارد 5-11 اطلاعات ضروری برای تکمیل مشخصات نمونه