دانلود تحقیق تعریف عیار پروتئین

تعریف عیار  پروتئین:

اسیدینه ای را که در واکنش فوق ظاهر میگردد میتوان در مجاورت فنل فتالئین با سود تیتره نموده و از روی عبارت پروتئین به نسبت درصد پروتئینهای موجود در شیر پی برد. عیار پروتئین که به (Eiweisstiter=Et) نشان داده میشود عبارتست از تعداد میلی لیترهای سودکه برای 25 میلی لیتر شیر لازم است تا پس از اضافه کردن فرمالدئید در مجاورت فنل فتالئین رنگ استاندارد بدست آید عیار پروتئین در شیرهای تازه نسبت درصد مقدار پروتئین را نشان میدهد.

وسائل لازم برای آزمایش:

یک بورت مدرج (تا 01/0 میلی لیتر).

2بشر 250تا 400 میلی لیتری

یک پیپت 25 میلی لیتری.

یک پیپت 5/0 میلی لیتری

درصورت امکان می توان از دستگاه سنجش پروتئینهای شیر ساخت ژربر استفاده نمود. این دستگاه شامل بورتیست که ستون مدرج آن نسبت درصد پروتئینها را مستقیماً در 25 میلی لیتر شیر نشان میدهد.

معرف های لازم برای آزمایش:

محلول سود(n143/0) عاری از

محلول الکلی فنل فتالئین(2گرم فنل فتالئین را با الکل 96 درجه به 100 میلی لیتر میرسانیم).

محلول اکسالات دو پتاس (28 گرم اکسالات دوپتاس خنثی را با آب مقطر به 100 میلی لیتر میرسانیم).

محلول تجارتی فرمالین 40 درصد

محلول سولفات دوکوبالت (25 گرم سولفات دوکوبالت  را با آب مقطر به 100    میلی لیتر میرسانیم).

در صورت امکان میتوان از معرفهای آماده ساخت ژربر که برای 200 آزمایش کافیست استفاده نمود.

مشخصات نمونه مورد آزمایش:

شیر مورد آزمایش نباید حاوی مواد نگهدارنده مانند بی کرمات دوپتاس یا فرمل باشد نمونه را قبل از آزمایش بحرارت 20 درجه سانتیگراد رسانده و بدون اینکه کف کند خوب بهم میزنیم.

طرز عمل:

الف)تهیه رنگ استاندارد:

در یکی از بشرها 25 میلی لیتر شیر, یک میلی لیتر از محلول اکسالات دوپتاس و 5/0 میلی لیتر از محلول 5 درصد سولفات کوبالت میریزیم رنگ استاندارد باید هر ساعت یکمرتبه تعویض گردد.

ب)تیتراسیون:

در بشر دیگر 25 میلی لیتر شیر, یک میلی لیتر از محلول اکسالات دوپتاس و 25/0 میلی لیتر فنل فتالئین ریخته و پس از اینکه بهم زدیم با سود تیتره مینماییم و با رنگ استاندارد مقایسه می کنیم. سپس 5 میلی لیتر از فرمالین 40درصد اضافه نموده و پس از لااقل یک دقیقه تا بدست آمدن رنگ گلی مشابه استاندارد باسود تیتره مینماییم. میلی لژترهای سود مصرف شده عیار پروتئین شیر را نشان میدهد.

دقت آزمایش:

این آزمایش تا03/0 درصد پروتئین را نشان می دهد. آزمایش فوق العاده سریع بوده و در مورد تعداد زیاد نمونه چنانچه با یکدستگاه 2 نفر کار کنند هر آزمایش بیش از 2 دقیقه بطول نخواهد انجامید.

روش تیتراسیون فرمل در عمل بیشتر برای سنجش نسبت درصد پروتئین شیرهای مخلوط و اندازه گیری با زده پنیرسازی مورد استفاده قرار میگیرد و در مورد شیرهای انفرادی(یا شیر یک سر دام) دقت زیادی ندارد.

علل اصلی اشتباه در عمل:

علل اصلی که ممکن است موجب اشتباه در عمل گردند عبارتند از:

تغییر عیار سود مثلاً با جذب اتیدرید کربنیک موجود در هوا.

استعمال فنل فتالئینی که کاملاً خنثی نباشد.

کندی یا سرعت زیاد در تیتراسیون.

وجود کف در نمونه شیر.

ترشی شیر

روش نصب رنگ:

اهمیت و موارد استعمال آزمایش: روش نصب رنگ سریعترین روشی است که در حال حاضر برای سنجش پروتئین های شیر تعداد زیادی نمونه (چندین صدتا چند هزار در روز) مورد استفاده قرار میگیرد. این روش مخصوص آزمایشگاههای بزرگ و کارخانه هائیست که روزانه مقدار زیادی شیر برای تهیه پنیر دریافت مینمایند و به منظور پرداخت بهای شیر و بهبود تولید شیر(از نقطه نظر کمیت و کیفیت) بکار میرود.

اصول آزمایش:

اساس این روش عبارتست از نصب رنگهای آنیلین بر روی پروتئین ها که ابتدا بوسیله Fraenkel-Conrat  و Cooper مطالعه شده و سپس دو شیمیدان آلمانی به نامهای Udy , Hetzel , Schober آمریکایی از این اصل به منظور سنجش پروتئینهای شیر استفاده نموده اند.

عاملهای قطبی پروتئینها رنگهایی را که دارای بار الکتریکی مخالف باشند بخود جذب مینمایند. پروتئینهای شیر پائین تر از نقطه ایزوالکتریک یا بعبارت دیگر در سمت اسیدی این نقطه بار الکتریکی مثبت نشان داده و بعنوان کاتیونها عمل مینمایند. حال درصورتیکه یک ماده رنگی حاوی بار الکتریکی منفی در محلول داخل نماییم با پروتئین تشکیل کمپلکس غیر محلولی از پروتئین و رنگ میدهد. برای اینکه رسوب پروتئین کامل گردد مقدار بیش از اندازه رنگ لازم است. مقدار پروتئین از روی مقدار آزاد رنگ(که بر روی پروتئینها نصب نگردیده است) سنجیده شده و به وسیله اندازه گیری دانسیته اوپتیک مایع باقیمانده اندازه گیری میشود.

رنگهای مورد استفاده:

رنگهایی که معمولاً در این روش مورد استفاده قرار میگیرند عبارتند از:

سیاه آمیدوB10, Orange G  و Acid orange 12  که فرمول ساختمانی آنها بقرار ذیل است:

Amido Black 10B

Orange G

Acid Orange 12

در اروپا آزمایشگاههایی که برای سنجش پروتئینهای شیر از روش نصب رنگ استفاده مینمایند سیاه آمیدوB10 مخصوص الکترو فورز ساخت کارخانه EMerck آلمان را بکار میبرند سیاه امیدو ساخت سایر کارخانه ها نیز در بازاریافت میشود ولی از نقطه نظر خلوص چندان مطلوب نیست. بهترین نوع سیاه آمیدو نوعیست که درجه خلوص آن 86 درصد است.

شرائط انجام آزمایش:

نگهداری نمونه ها:

مواد نگهدارنده معمولی مانند بیکرمات دوپتاس یا فرمل برای نگهداری نمونه جهت این آزمایش مناسب نیستند و در این مورد باید از بی کلرور دومرکور استفاده نمود(ولی در استعمال این ماده باید احتیاط کامل رعایت گردد). نمونه ها را باید در حرارت 2 تا 4 درجه سانتی گراد نگهداری نمود.

روشهای آزمایش:

الف)سیاه آمیدو(طریقه Raadsveld).

وسائل لازم برای آزمایش:

اسپکتروفوتومتر.

سرنگ یک میلی لیتری(Cornwall).

پیپت 20 میلی لیتری.

سانتریفوژ با دور2500 در دقیقه.

در صورت امکان میتوان از دستگاه Pro –Milk MK II ساخت کمپانی دانمارکیA/S N.Foss Electric.  استفاده نمود با این دستگاه میتوان در هر ساعت 50 تا 60 نمونه شیر را مورد آزمایش قرار داد.

معرفهای لازم برای آزمایش:

سیاه آمیدوB10 مخصوص الکتروفورز ساخت کارخانه E.Merck آلمان

محلول تامپون 35/2=pH

برای تهیه این محلول 674/1 گرم (اتیدر) و 371/17 گرم اسیدسیتریک را درآب حل کرده و حجم انرا به یک لیتر میرسانیم و pH آنرا بدقت در 35/2 تنظیم مینماییم.

محلول رنگ و تامپون:

44/0 گرم سیاه آمیدو B10 را بیک لیتر از محلول تامپون سیترات – فسفات اضافه نموده خوب بهمزده و مدت 24 ساعت به حال خود میگذاریم و سپس آنرا با طول موج  با اسپکتروفوتومتر استاندارد مینماییم.

دانسیته اوپتیک این محلول ( به رقت ) با اسپکتروفوتومتر 68 coleman Junior معادل 005/0320/0 میباشد.

طرز عمل:

نمونه های مورد آزمایش را در حرارت آزمایشگاه گرم نموده و چندین مرتبه خوب تکان میدهیم تا چربی سطحی با شیر کاملاً مخلوط گردد.

با سرنگ مخصوص به دقت 5/0 میلی لیتر از نمونه آزمایش برداشته و در لوله سانتریفورژ وارد مینماییم, سپس با یک پیپت 20 میلی لیتری معمولی یا خودکاردقیقاً20 میلی لیتر از محلول رنگ و تامپون بآن اضافه نموده مدت لااقل 30ثانیه بهم میزنیم تا شیر و رنگ کاملاً با یکدیگر مخلوط گردندو بعد لوله ها را در داخل سانتریفورژ قرارداده مدت 5 تا 10 دقیقه با دور 2500 در دقیقه سانتریفوژ میکنیم سپس یک میلی لیتر از مایع فوقانی داخل لوله سانتریفوژ برداشت نموده با 25 میلی لیتر آب مقطر رقیق مینماییمو دانسیته اوپتیک آنرا در یک طشتک یک میلی لیتری با طول موج نسبت به آب مقطر اندازه گیری مینماییم. پس از اینکه رابطه بین دانسیته اوپتیک و مقدار پروتئینها معلوم گردید, ستون مدرج کلریمتر را میتوان مستقیماً برحسب گرم پروتئین در کیلوگرم شیر مدرج نمود.

ب)Orange – G (طریقه Ashworth )

معرفهای لازم برای آزمایش:

محلول Orange – G:

برای تهیه این محلول یک گرم Orange – G , 26 گرم اسید سیتریک و 5/2 میلی لیتر از محلول 10درصد تیمول(که برای نگهداری بکار برده میشود) را در آب حل کرده و حجم آن را به یک لیتر میرسانیم.

طرز عمل

در یک ارلن میر 50میلی لیتری شیر و 5/2 میلی لیتر از محلول Orange – G ریخته و دهانه آن را بسته و تقریباً 15 ثانیه تکان میدهیم سپس مدت نیم ساعت بحال خود گذاشته روی کاغذ صافی صاف میکنیم و دانسیته اوپتیک مایع صافی را در یکدستگاه اسپکتروفوتومتر با طول موج  اندازه گیری مینماییم.

تنظیم رابطه بین دانسیته اوپتیک محلول و مقدار پروتئینها:

همانطور که در درجه بندی ستون مدرج چربی سنجهایط که برای اندازه گیری چربی شیر بکار برده میشوند براساس مقایسه با نتایج حاصله از یک روش مرجع مقایسه مثلاً روش رز – گوتلیب انجام گردیده است, رابطه بین داتسیته اوپتیک و مقدار پروتئینها نیز باید با استفاده از یک روش مرجع مقایسه ( که در این مورد روش کیلدال است) و مقایسه نتایج حاصله تنظیم گردد. برای اینکار باید مقدار پروتئین تعدادی نمونه شیر را (شیرهای انفرادی) به طریقه کیلدال و نصب رنگ تواماً تعیین نمود واز مقایسه آنها جدولی تهیه و در تعبیر نتایج حاصله مورد استفاده قرار داد.

محاسبه ظرفیت نصب رنگ:

محلول رنگی-غلظت رنگ در مایع تامپون

مقدار رنگی را که در مایع فوقانی لوله سانترژفوژ باقی میماند, میتوان از رابطه زیر برحسب میلی گرم محاسبه نمود:

مقدار رنگ بر حسب میلی گرم

که در آن دانسیته اوپتیک محلول رنگ و تامپون,دانسیته اوپتیک مایع فوقانی لوله سانتریفورژ و فاکتور رقت.

مقدار پروتئینها بطریقه کیلدال از رابطه زیر بدست میاید:

38/6*(نسبت درصد ازت غیر پروتئینی – ازت کلی) = نسبت درصد پروتئینها

نسبت درصد پروتئین*وزن نمونه = مقدار پروتئینها بر حسب گرم.

مقدار رنگ باقیمانده در مایع فوقانی لوله سانتریفوژ- مقدار رنگ در 20میلی لیتر محلول رنگ و تامپون برحسب گرم

ظرفیت نصب رنگ از رابطه زیر بدست میاید:

مقدار پروتئینها بر حسب گرم

 = ظرفیت نصب رنگ

مقدار رنگ بر حسب میلی گرم/مقدار پروتئینها بر حسب گرم=

مقایسه روشهای سیاه آمیدو و Orange – G:

روش سیاه آمیدو از روش Orange –G حساس تر است. بعلاوه سیاه آمیدو با پروتئینها سریعتر واکنش نشان داده و چون دانسیته کمپلکس رنگ و پروتئین حاصله بیشتر است در اثر نیروی گریز از مرکز بهتر و ساده تر برداشته میشود.

تعیین مقدار کازئین شیر(روش استاندارد بین المللی):

موارد استعمال آزمایش:

این آزمایش باید در مورد شیر تازه انجام شود چنانچه آزمایش شیر در فاصله 24 ساعت امکان پذیر نباشد, به نسبت 1 در 2500 فرمل به آن اضافه نموده و در جای خنک نگهداری مینماییم.

اصول آزمایش:

منظور از مقدار کازئین شیر نسبت درصد وزنی مقدار پروتئین است که بعد از رسوب دادن در 6/4=pH بدست میآید. اساس این ازمایش عبارت از این است که ابتدا مقدار ازت کلی شیر را بطریقه کیلدال تعیین نموده و سپس کازئین را بوسیله یک تامپون اسید استیک و استات رسوب داده و صاف مینماییم. بعد مقدار ازت کلی مایع صافی را نیز بهمین روش تعیین نموده و مقدار کازئین را از روی این دو سنجش محاسبه مینماییم.

وسائل لازم برای آزمایش(رسوب دادن کازئین):

پیپت 5/0, 1 و10 میلی لیتری

پیمانه استوانه ای مدرج به گنجایش 100 میلی لیتر.

بالن ژوژه به گنجایش 100 میلی لیتر

کاغذ صافی و قیف

معرفهای لازم برای آزمایش (رسوب دادن کازئین)

محلول 10درصد اسید استیک.

محلول نرمال استات دوسود

طرز عمل:

بطوریکه قبلاً نیز ذکر گردید, ابتدا مقدار ازت کلی(AT) شیر مورد ازمایش را به روش کیلدال تعیین نموده و سپس کازئین را به ترتیب زیر رسوب میدهیم:

با یک پیپت 10 میلی لیتری 10 میلی لیتر از نمونه شیر را برداشته و در ییک بالن ژوژه 40تا42 درجه سانتی گراد و یک میلی لیتر از محلول اسیداستیک بآن اضافه نموده محتوی بالن را به ملایمت بهم زده و مدت 10 دقیقه صبر مینماییم سپس یک میلی لیتر تز محلول استات دوسود به بالن اضافه نموده و مجدداً بهم میزنیم. محتوی بالن را تقریباً 20 درجه سانتی گراد سرد مینماییم و با آب حجم آن را به 100 میلی لیتر میرسانیم و باوارونه کردن بالن انرا خوب تکان میدهیم وقتی رسوب کازئین و چربی تشکیل گردید آنرا روی یک صافی که با اسید شسته شده باشد صاف کرده و مایع صافی را در یک ظرف خشک و تمیز دریافت مینماییم کاغذ صافی را یکی دو مرتبه میشوییم بعد مقدار ازت مایع صافی را روی 50 میلی لیتر به طریقه کیلدال تعیین مینماییم.