ازهنگامی که ذرات ویروسی برای اولین بار در سال 1962 در بافتهای خوراکی biporus Agaricus توسط هولینگزمشاهده شد.
ویروسها و ذرات شبه ویروسی (VLPs ) متجاوز از 100 گونه مختلف متعلق به گروههای عمده قارچها گزارش شده است.
همچنین هولینگز در1978 تخمین زد که قارچ ویروسها ممکن است درحداقل 5000 گونه از قارچهاوجودداشته باشد.استفاده ازواژه ذرات شبه ویروسی به جای ویروس درمواردی بکارمی رود که«قارچ ویروس» جدا نشده ومشخصات آن نیز تعیین نشده است .
اغلب می توان آنها را در آلودگیهای رایج قارچی مشاهده کرد که دربعضی صفات خاص شبیه ویروسهای متداول هستند و در ژنوم آنها نیز شباهتهایی با پلاسمیدها وجود دارد.
غالباً دارای RNA دورشته ای و چند قسمتی بوده که این قطعات معمولاً جداگانه ولی درون ذرات شبیه هم قرار دارند.
قارچ ویروسها اغلب دارای ذرات ایزومتریک به قطر nm48-25 هستند ولی ذرات باسیلی فرم، میله ای فرم و ذرات گرد خال مانند(Herpeslike) نیز گزارش شده است.انتقال آنها اغلب طی تقسیمات سلولی و ترکیب سلولی و تولید اسپور در میزبان قارچ صورت می گیرد.
هنوز ناقل طبیعی کارایی برای آنها شناخته نشده است که شاید به همین دلیل دارای دامنه میزبانی محدودی در بین گونه ها و جنسهای قارچها می باشند.
نکته قابل توجه این است که مایکوویروسها سبب آلودگیهای پنهان در قارچهای میزبان خود می شوند, همچنین در آلودگیهای ویروس در مخمرها همراه بودن پروتئینهای کشنده کاملاً محرز است.
اخیراً ازآنها درکنترل بیولوژیک وایجاد نژادهای کم تهاجم قارچی(Hypovirulent) وهمچنین فعالیتهای بیولوژیکی آنتی ویروسی و آنتی توموری و ...
استفاده می شود.
تاریخچه :
ازهنگامی که ذرات ویروسی برای اولین بار در سال 1962 در بافتهای خوراکی biporus Agaricus توسط هولینگزمشاهده شد.
همچنین هولینگز در1978 تخمین زد که قارچ ویروسها ممکن است درحداقل 5000 گونه از قارچهاوجودداشته باشد.
دلایل نا شناخته ماندن آنها :
مایکوویروسها به چهار دلیل از ویروسهای روی گیاهان و حیوانات و باکتریها دیرترکشف شدند.
1.
بسیاری از قارچهای تحت تأثیر ویروس علائمی از خود نشان نمی دادند.
2.
در مورد قارچهای رشته ای ممکن است تحقیق کردن در مورد آنها یا ایزوله کردن آنها از منابع طبیعی سخت باشد.
زیرا ایزوله های آنها یا خوب رشد نمی کنند و یا در شرایط آزمایشگاهی کولونیهایی می دهند که با کلونیهای ایجاد شده توسط آنها در طبیعت متفاوت است.
3.
انتقال آزاد سلولی یا خالص سازی ویروس مشکل است و باید تحت شرایط کنترل شده دقیق صورت گیرد تا طی تلقیح ویروس خالص سازی شده, همان آلودگی ناشی از اسپورهای قارچی هوازاد آلوده به این ویروس در میزبان زراعی را ایجاد کنند.
4.
بیماریهای قابل انتقال قارچی نظیر victoria Helminthosporium را یک بیماری ویروسی می دانستند در صورتیکه با تکنیکهای ویروس شناسی قابل شناسایی نبودند.
با وجود اینکه علائم آنها شبیه بیماری ویروسی نبود دانشمندان آن را بیماری ویروسی تصور می کردند که اتفا قاً از روی همین علائم و تضادها اولین مایکوویروسها کشف شدند.
کلیات:
انواع مورفولوژیکال متعددی از اجسام شبه ویروسی در قارچها یافت شده اند و مقدار کمی از اینها ( VLPs ) از قواعد ویروسها تبعیت می کنند .
استفاده از واژه شبه ویروس به جای ویروس در مواردی بکار می رود که «قارچ ویروس» جدا نشده و مشخصات آن نیز تعیین نشده است .
و واژه ویروس برای ذراتی که از نظر مورفولوژیک مشابه ویروس هستند, خالص سازی شده و ژنوم اسید نوکلئیک در یک پوشش پروتئینی در آنها مشاهده شده است .
با وجود اینکه در مواردی عفونت زایی هم ندارند.
جدولی در سال 1986 ارائه شد که شامل حدود 200 (VLPs ) در متجاوز از 100 گونه قارچ بود.
به دو دلیل اعتقاد داشتند که تعدادواقعی ( VLPs ) از این مقدار ممکن است کمتر باشد:
1.
بعضی از VLP ها ممکن است دارای ژنوم دوقسمتی باشند به عنوان مثال, VLP های ایزومتریک ظاهراً با ابعاد اندازه گیری شده مختلف که در
آزمایشگاههای مختلف اندازه گیری شده اند در واقع مشابه هستند این موضوع با اندازه گیری ابعاد ذرات,از یک نژاد مشابه Penicillium chrysogenum که ابعاد آن از 40 35 نانو متر متغیر است مشخص می شود .
متغیرهای زیادی هستند که اندازه گیری ابعاد این ذرات را توسط میکروسکوبهای الکترونی تحت تأثیر قرار می دهند.
از جمله این عوامل متغیر می توان به 1 رنگ استفاده شده 2 درجه خلوص ویروس 3 تجمع ذرات ویروس 4 استاندارداهایی که در کالیبراسیون استفاده می شود, را نام برد.از این رو زمانیکه این ذرات با اندازه های مختلف متعدد از یک گونه خاص قارچ گزارش شدند اغلب کاملاً مشخص نیست که دقیقاً چند نوع مختلف VLP را ارائه داده اند.
بطور مثال در Pyricularia oryzae دو ذره به ابعاد nm30 وnm 45 از یک آزمایشگاه و دو ذره دیگر با ابعاد nm 36 35 و nm 25 از آزمایشگاه دیگر گزارش می شود حال معلوم نیست که این گزارشات مربوط به 4 ( VLPs ) مجزا هستند و یا هر دو اندازه ذرات مذکور در آزمایشگاههای مختلف متفاوت به همان دو ذره ( VLPs ) بر می گردد.
بعضی از VLPها ممکن است در واقع ویروس نبوده بلکه با عناصر ویروسی اشتباه گرفته شوند بطور مثال از عناصر سلولی که ممکن است در برشهای بسیار باریک تهیه شده جهت بررسی با میکروسکوپ الکترونی با VLP ها اشتباه شدند می توان گرانولهای گلیکوژن و ذرات گاما را نام برد.
درتحقیقی جهت بررسی این امرکه آیا امکان این هست که ویروسهایی که ازنژادهای مختلف Slime mold , ( Physarum polycephalum) گرفته شده اند بتوانند واکنشهای بدنی را تحت تأثیر قرار بدهند محققین متوجه شدندکه علت رفتار مختلف نژادهای مختلف این قارچ در این تستها بخاطر تفاوت در تعداد نسخه های این اجزا هست.
از طرف دیگر اسپکترومتریک نشان داد که اینها پیک جذب درnm 260 یا nm 280 که مختص اسید نوکلئیک و پروتئین هست را ندارند در نتیجه به این نتیجه رسیدند که ممکن است این اجزا گرانولهای گلیکوژن باشند.
این نتیجه گیری با مشاهده حساسیت آن نسبت به آلفا ـ آمیلاز قوت گرفت.
این نتیجه در مورد قارچهای Clindrocladium scoparium , Lentinus edodes , Schizophyllum commune صادق است.
اما در مورد ذرات گاما , این ذرات در زمان اسپوروژنز از گرانولهای دارای بار شکل می گیرند.
در حدود 40 نانومتر قطرشان هست.
در داخل سیسترنهای شبکه آندوپلاسمیک دانه دار ظاهر شده که با هم آمیخته و تشکیل تجمعات nm 100 را می دهند.
در برشهای عرضی ذرات گاما توسط سه لایه پوشیده شده اند که لایه بیرونی غشاء لیپیدی است.
زئوسپورهای Blastocladiella emersonii دارای 12 ذره گاما و همچنین در سایر کتریدیومیستها از جمله Allomyces arboscular , Allomyces macrogenus , Catcuaria anguilulae , Coelomomyces punctatus , Coelomysidium simulii , Olpidium brassicae , Phlyctochytrium irregulare , Rozella allomyces .
ذرات گاما از نظر مورفولوژی و سایز ترکیبات پایه DNAها مشابه Poxvirus ها هستند.
هیچ شاهدی مبنی بر این نداریم که این ذرات گاما , خودشان عفونت زا هستند و یا خودشان توانایی نسخه نویسی را دارند برای همین ناخواسته کاندیدای ویروس بودن هستند چون وابسته اند.
شواهد خوبی وجود دارد که ذرات گاما تشکیل سیتزوم می دهند.
سیتزومها وزیکولهای کروی هستند که شامل کمپلکس کتین سنتتاز که توانایی تشکیل میکروفیبریلهای کتین را دارا هستند.
کار آنها این است که کتین سنتتاز را به سایتهایی که میکروفیبریلها انباشته می شوند در سطح سلولهای قارچ انتقال می دهند احتمالاً حضوردر قارچهای کتین ساز از قبیل Allomyces sp.
, Mocur sp.
, Neurospora sp.
, Saccharomyces sp.
, Agaricus sp.
و زئوسپورهای Blastocladiella emersonii که فاقد دیواره سلولی هستند یافت می شوند.
در غیاب سنتز RNA و پروتئین , در طی تشکیل زئوسپور, ذرات گاما از نظر ظاهری تغیر کرده و وزیکولهای متعددی در حدود nm 80 آزاد می کنند.
این وزیکولهای ذرات گاما به سطح اسپور مهاجرت کرده و به غشاء سلولی می پیوندند که این واقعه همزمان با ظهور دیواره اولیه سیست اتفاق می افتد.
در مطالعات Invitro نشان داده شده است که ذرات گاما ایزوله شده فعالیت کتین سنتتاز را نیز شامل می شوند.
این ذرات بیشتر به عنوان عناصر سلولی طبقه بندی می شود و کار و طریقه نسخه نویسی DNA آنها مشخص نیست.
از سایر ساختارهایی که ممکن است با VLP ها اشتباه شوند بخشهای کوچک سلولها شامل تجمعات کریستالین پروتئینها مانند الکل دهیدروژناز در Saccharomyces carlsbergensis و گرانولهای پلی فسفات در برشهای عرضی از ساختارهای توبولار دستگاه گلژی و ساختارهای غشایی ساخته شده توسط دستورالعمل میتوکندریهای موجود در سلولهای مخمر در حال جوانه زنی.
همانطور که گفته شد مسلماً نیاز مبرمی به ایزوله کردن و تعیین مشخصات VLP ها یی که با میکروسکوپ الکترونی یافت شده اند احساس می شود قبل از اینکه بطور قطعی بتوان آنها را ویروس نامید.
مرفولوژی : ژنوم قارچ ویروس دارای شباهتهایی با ژنوم پلاسمید می باشد .
اغلب دارای ذرات ایزومتریک به قطورnm 25 ـ 45 می باشند اما گاهی ذرات باسیلی شکل, میله ای شکل , نخی شکل, گرزی شکل و همچنین ذرات گرد خال مانند Herpslike ) ) گزارش شده است.
اغلب دارای dsRNA چند قسمتی بوده که این قطعات معمولاً جداگانه ولی درون ذرات شبیه هم قرار دارند.
در زیر به گروههای مختلف ( VLPs) با توجه به فرم ذرات و محتوی ژنوم آنها اشاره می کنیم : ذرات میله ای شکل ( Rod – shaped ) : در قارچهای آسکومیست, بازیدیومیست و قارچهای ناقص کشف شده اند.
که این ذرات میله ای شکل محتوی ssRNA هستند و شامل گروههای ویروسی: -Tabamovirus -Forovirus -Tobravirus -Hordeivirus -Tobaco stunt virus group که از جمله اینها می توان TMV – like particle را نام بردکه بر روی زنگها شامل Puccinia sp.
, Coleosporium sp.
, sp.
Uromyces و سفیدکهای پودری شامل Erysiphe sp.
, Phylactinia sp .
, Sphaerotheca sp.
دیده شده اند.
ذرات نخی شکل ( Flexuous Rod – shaped ) : در قارچهای آسکومیست , بازیدیومیستها و قارچهای ناقص و ماستیگومایکوتینا کشف شده اند.
این ذرات محتوی ssRNA هستند و شامل گروههای ویروسی : -Potexvirus -Clastrovirus -Carlavirus -Rice strip virus group -Potyvirus که از جمله اینها می توان گروه Clastrovirus را که بر روی Synchytrium endobioticum عامل بیماری زگیلی سیب زمینی از کیتریدیومیستهاست را نام برد.
ذرات باسیلی شکل ( Bacilliform and Bullet – shaped ) : محتوی ssRNA وشامل گروه ویروسی Rhabdoviridae هست که به عنوان مثال می توان ذرات alfalfa mosaic virus را که ذراتی بدون پوشش ( non – involved) هستند و بر روی Agaricus bisporus اثر می گذارند را نام برد.
ذرات گرزی شکل ( Club – shaped ) : محتوی dsRNA که از آن جمله می توان ویروسهای روی قارچ Endothia parasitica عامل بیماری سوختگی شاه بلوط Chesnut blight را نام برد.
ذرات Enveloped pleomorphic : بر روی Neurospora crassa و Saccharomyces sp.
میتوان آنها را یافت .
ذرات گرد خال مانند ( Herpslike ) : محتوی DNA هستند .
این ذرات خارج سلولی و پوشیده شده با غشاء هستندو بر روی Oomycetes مورد بررسی به موارد زیر می توان اشاره کرد: ـ Phytophthora parasitica var.
parasitica ـ Schizochytrium aggnegatum ـ Thraustochytrium sp.
( بیش از بقیه مورد بررسی بوده است.) ذراتی با سر و دم (Particle with Heads and Tails ) : اینها را می توان بر روی Saccharomyces carlsbergensis مشاهده کرد, همچنین از این گروه به باکتریوفاژهایی که روی نمونه های زراعی از پنیسیلیوم پیدا شده اند می توان اشاره کرد.
Geminate particle : محتوی ssDNA می باشند و روی ایزوله های کندرشد از Neurospora crassa یافت می شوند.
ذرات ایزومتریک : از نظر محتوی ژنوم به چهار دسته تقسیم می شوند: dsRNA ها , که از این گروه می توان Penecillium stoloniferum , Penecillium citrinum , Allomyces arbuscular را نام برد.
ssRNA ها ,که از Oomycetes بر روی سفیدک دروغین برنج Sclerophthora macrospora اثر می گذارد.
dsDNA ها , تنها ذرات ایزومتریک بدون پوشش که بر روی Rhizidiomyces sp.
از کیتریدیومیستها اثر می گذارد.
( این قارچ پارازیت روی Achyla و Saprolegnia از Oomycetes می باشد.) VLP هایی از قارچهای پست با ابعادی بین nm200 – 40 که بر روی قارچ Albugo candida اثر می گذارد.
Retrovirus – like particle : این گروه بر روی Saccharomyces cerevisiae تأثیر می گذارد.
انتقال : انتقال قارچ ویروسها اغلب طی تقسیم سلولی, ترکیب سلولی و تولید اسپور در میزبان قارچ صورت می گیرد.
هنوز ناقل طبیعی کارایی برای قارچ ویروسها شناخته نشده است و یکی از مشکلات عمده آنها عدم وجود آزمونهای مرسوم بیماریزایی مثل انتقال با مایه زنی عصاره به میزبان سالم است.
بیشتر قارچ ویروسها رابطه سرولوژیکی با هم ندارند و دامنه میزبانی محدودی در بین گونه ها و جنسهای قارچها دارند.
دلیل این اختصاصی بودن آشکار ممکن است به علت عدم وجود ناقلین مشخص یا نبود روشهای انتقال آزمایشگاهی خاص باشد تا عدم توانایی آنها به آلودگی گونه های قارچی مختلف.
علائم : هر چند اغلب ویروسهای گزارش شده بدون علائم بیماری هستند و یا آلودگی نهفته در میزبانهای قارچی ایجاد می نمایند, ولی تأ ثیرات آلودگیهای ویروسی در قارچ خوراکی کاملاً محرز است.
از جمله علائم روی قارچ Agaricus bisporus به شرح زیر است: اسپوروفر یا کلاهک قارچهای آلوده کوچک, بدشکل و ممکن است چروکیده و یا آبکی باشد.
معمولاً ساقه قارچ بیمار در اثر بیماری کشیده شده و قارچ به شکل چوب طبل و یا بشکه ای شکل در می آید.
کلاهک قبل از موعد باز می شود.
باید توجه داشت که این علائم ممکن است در اثر عوامل زیست محیطی و زراعی نیز بوجود آید.
بطور کلی بیماریهای ویروسی روی قارچهای خوراکی ممکن است علائم مشخصی نداشته باشند و کاهش میزان محصول در واحد سطح شاید بهترین و مشخص ترین علامت بیماری باشد.
ویروس باعث ضعیف شدن و کاهش میسیلیوم قارچ می شود.
این میسیلیوم در محیط کشتهای مصنوعی نیز در مقایسه با قارچ سالم از رشد مطلوبی برخوردار نیستند.
بیماری ویروسی در قارچ Agaricus bisporus : قارچ خوراکی Agaricus bisporus در اروپا 300 سال و در امریکا حدود یک قرن است که پرورش داده می شود اولین بار علائم بیماری آبکی شدن ساقه در سال 1948 توسط برادران لافرانس مشاهده شد که بنا به همین دلیل به بیماری لافرانس هم شهرت یافت, در استرالیا و ژاپن تحت نامهای بیماری x , بیماری قهوه ای, آبکی شدن ساقه و خشکیدگی قارچ ( die - back ) گزارش شده است.
با اینکه علائم خیلی زود مشاهده شد ولی تا مدتها تصور نمی شد که بیماری ویروسی باشد تا اینکه در سال 1959 گاندی بطور قاطع نشان داد که این بیماری بوسیله قطعات میسیلیوم انتشار می یابد و عامل انتقال آناستموز میان هیفها بوده که همین مسئله منجر به دلالت بر یک فاکتور سیتوپلاسمیکبه عنوان عامل بیماری شد.
چند سال بعد در سال 1962 هولینگز اولین قارچ ویروس را روی Agaricus bisporus کشف کرد و سپس سه نوع ذره از قسمت میوه قارچ بیمار در انگلستان بدست آورد که 2 ذره آن ایزومتریک و تحت نامهای MV1 , MV2 نامیده شد و ذره سوم که باسیلی فرم بود به نام MV 3 نامیده شد.
بعدها دو ذره ایزومتریک دیگر به قطرهای nm 34 و nm 35 به نامهای MV4 , MV5 کشف شد.
اما رایجترین آنها ذرات باسیلی فرم و ذرات ایزومتریک با قطرهای nm 25, nm 34 , nm 35 بوده است.این بیماری موجب خسارت شدید به محصول قارچ خوراکی در بسترها می شود, همچنین انتقال ویروس از طریق اسپور و بذر قارچ به راحتی صورت می گیرد.
کنترل: در مراکز پرورش قارچ ممکن است از طریق میسیلیومهای سالم ( Spawn ) , استریل سازی کمپوست , استریل کردن بسترهای پرورش قاچ و استفاده از فیلترهای هوا جهت جلوگیری از ورود اسپورهای آلوده به ویروس, کنترل می شود.
ارائه دو سیستم مدل از مایکوویروسها بیماری مسری Helminthosporium victoriae ؛ گواهی برای بیماری شناسی ویروسی مقدمه: حداقل 4 انگیزه اصلی برای شناسایی و مطالعه عوامل میرمسی در بیماریهای قابل انتقال Helminthosporium victoriae می باشد.
بیماری ویروسی H.
victoriae سیستمی بوجود می آورد که از آن می توان برای مطالعه در مورد تأثیرات آسیب شناختی قارچ ویروسها در قارچهای رشته ای استفاده کرد.
در این بررسی ما به این نتیجه می رسیم که اکثریت قارچ ویروسها غیر بیماریزا هستند و معمولاً هیچ اثر زیان آوری بر روی میزبان خود ندارند.
علائم این بیماری به عنوان نشانه های با ارزشی در تشخیص و شناسایی قسمت های مبتلا شده قارچ که مورد آزمایش یک دوره ویروسی قرار گرفته است به کار می رود.
تلاشهای اخیر برای به وجود آمدن یک سیستم آزمایشی برای انتقال قارچ ویروس به صورت بدون سلول به علت عدم وجود علائم قابل شناسایی مختل شده است.
اخیراً برای شناسایی میسیلیومهای مبتلا شده نیاز است که مسیسیلیوم مجزا با استفاده از کلونیهای بزرگ قارچی تولید شده و در مورد وجود ویروس و یا اسید نوکلئیک ویروس مورد بررسی قرار گیرند.
H.
victoriae یک سیستم مدل علی را برای مطالعه قارچ های بیماری که میزان بیماریزایی آنها بستگی به میزان تولید توکسین توسط میزبان خود دارد را ارائه می دهد.
از آنجایی که بیماریهای مربوطه به H.
victoriae بصورت Hypovirulent هستند و میزان تولید توکسین توسط یک ژن کنترل می شود .
مطالعات و بررسی در مورد واکنشهای درون پلاسما هسته باعث کشف نقش مهم قارچ ویروس ها در بیماریزایی در این سیستم می شود و ممکن است در بعضی قارچهای بیماریزای دیگر باعث تولید توکسین در میزبان شوند.
با بررسی موارد مبتلا به H.
victoriae که جداسازی شده اند نتایجی بدست آمد که نشان می دهد که آنها اقدام به تولید آنتی بیوتیک به همراه طیف وسیعی از فعالیتهای ضدقارچی و ضد باکتریایی کرده اند.
در نتیجه مطالعات انجام شده , آنتی بیوتیک طبیعی که به علت این بیماری تولید می شود , از آنجا که هنوز پدیده کشنده ای در قارچهای رشته ای کشف نشده است بسیار مورد توجه است زیرا برخلاف این آنتی بیوتیک مورد قبول در H.
victoriae پروتئین کد شده توسط dsRNA که در مخمرهای آلوده به ویروس وجود دارد می تواند به عنوان عامل کشنده و یا بازدارنده در وارد آمدن آسیب به گیاه مربوطه باشند.
علاوه بر این, تحقیقات انجام شده در مورد بیماری های قابل انتقال از H.
victoriae نشان می دهد که این سیستم می تواند زمینه خوبی برای تحقیقات و مطالعات آینده باشد.
تاریخچه: در سال 1946 میلادی عامل در H.
victoriae به عنوان عامل بیماری victoria blight در دانه های یولاف اعلام شد و مشخص شد که یک عامل بسیار اختصاصی می باشد و تنها آن دسته از یولافهایی که به زنگ تاجدار با عامل Puccinia coronata مقاوم هستند را مبتلا می کند.
بیماری که با عامل در H.
victoriae ایجاد شد کم کم به صورت اپیدمی در آمد تا جایی که در سال1947 و 1948 باعث ایجاد آسیب و زیان در اکثر مزارع یولاف در امریکا شد .
علاوه بر این کشت و درو گونه های دیگر یولاف که مشتق گرفته از victoria بودند در زمین زراعی لغو شد.
این نوع یولاف به رویش خود در قسمتهایی از جنوب امریکا تا سال 1950 ادامه داد.
در سال 1959 از طریق مشاهده و بررسی حالتهای غیرطبیعی که در گیاه یولاف در ایالت لوسیانا مشاهده شدبه این نتیجه رسیدند که نوع بیماری مشتق شده از H.
victoriae می تواند قابل انتقال باشد.
لیندربرگ مشاهده کرد که بعضی از کلونی های H.
victoriae که از یولافهای مبتلا شده بدست آمد به صورت غیرطبیعی و رشد ناقص پدیدار شده اند.
به دنبال یک دوره رشد و رویش طبیعی, در بخشهایی از حاشیه کلونی فروریزی همزمان و یا لیز شدن میسیلیومهای هوازی مشاهده شد و بطور کلی از گسترش کلونی جلوگیری شد.
او, این نمونه از ناهنجاری و وضعیت غیر طبیعی را به عنوان یک بیماری اعلام کردو نشان داد که این بیماری قابل سرایت به کلونی های سالم و طبیعی از طریق آناستموز در تماس با کلونی های آلوده می باشد.
از آنجا که در بخش لوسیانا گیاهان بیمار و سالم از یکدیگر جدا شده اند, در جایی که احتمال بیماری می رفت نیز مقدار زیادی خسارت اعلام نشد که این برای این نمونه از بیماری مربوط به یولاف غیر معمول بود.
پس پیشنهاد شد که کاهش در میزان بیماریزایی H.
victoriae ایجاد شده است و این خاصیت ممکن است به بیماری های قابل سرایت در قارچها منتقل شود.
ایزوله های زراعی مبتلا به H.
victoriae دارای دو نمونه ویروس اختصاصی بودند که از نظر سرولوژیکی و الکتروفورتیکالی و با توجه به نحوه رسوب گذاری انتخاب شدند و به نامهای 145s و 190s نامیده شدند.
نمونه های جداسازی شده نرمال حاوی هیچ ویروسی نبودند و یا فقط نمونه 190s را دارا بودند.
با توجه به مدارک مربوط در آن زمان نتیجه گیری شد که وجود ویروس 145s به تنهایی و یا در ترکیب با ویروس 190s می تواند باعث بروز بیماری شود.
ویروسهای روی H.
victoriae : ویروس190s بطور کلی یک ویروس ساده و تک قسمتی است, در حالیکه حاوی یک نمونه خاص از dsRNA می باشد.
ویروس 145s احتمالاًیک ویروس ترکیبی می باشد که دارای 4 نمونه خاص از dsRNA می باشد.
با تمرکز و بررسی بیشتر روی ویروس 145s , مشاهده می شود که ساختار آن بسیار متغیر است و بطور کلی میزان آن نسبت به ویروس190s بسیار کمتر می باشد؛ نسبت 145s به ویروس190s میزان 1 به 10 می باشد.
اجزای dsRNA ویروس 145s هیچ ارتباطی با یکدیگر ندارند و این موضوع مشخص نشده است که آیا اجزای مرکب dsRNA نشان دهنده یک ژنوم تقسیم شده و چند جزئی است و یا یکی یا چند تا از این اجزا انگل و یا جهش یافته هستند.
از دو روش برای کشف این دو ویروس استفاده شد: تولید یک سرم پادتن برای ویروس190s , که برای کشف ویروس با استفاده از تکنیک الایزا مورد استفاده قرار گرفت.
آنتی سرم مناسب برای ویروس 145s در حال حاضر موجود نمی باشد و آنتی ویروس موجود با استفاده از ترکیبی از دو ویروس145s و 190sتولید شد که در سیستم الایزا غیر قابل استفاده نمی باشد.
استفاده از رادیو ایزوتوپها که برای شناسایی و ردیابی ویروس 190s بکار می رود.
علائم بیماری و محتویات ویروس : بیماریهای جداسازی شده از استرینهای B-1 و A-9 در ابعاد مختلفی شبیه هم هستند .
در هر بخش ایزوله حاوی هر دو ویروس145s و 190s می باشد که با سرعتی کمتر از نمونه های معمولی رشد کرده اند و تولید بافت میسیلیومی غیر طبیعی می کنند و ممکن است مقدار کمی هاگ نیز تولید کنند.
این دو نمونه به طور کلی بر اساس علامت خارجی بیماری با هم تفاوت دارند.
ایزوله استرین B-1 با داشتن فروریختگی های سریع و مشخص میسیلیوم هوازی خود, در کلونیهای در حال رشد در دکستروزهای گوجه فرنگی قابل مشاهده است.
کل میسیلیوم هوازی در روزهای 7 تا 10 به کلی فرو ریخت.
نمونهA-9 دارای علائمی از قبیل کلونی رشد نکرده و ناقص همراه با میسیلیوم های کم پشت و بطور کلی از افزایش کلونی در روزهای 5 تا 6 جلوگیری شده است .
بخشهای رشته ای متورم شده در روزهای 7 تا 10 در کلونی مشاهده شد و همچنین فروریزی میسیلیوم های هوازی در مورد نمونه A-9 تنها محدود به PDA می باشد و در روزهای 10 تا 14 کاملاً آشکار در محیط مایع می باشد.
مهمترین علامت بارز در محیط مایع رویش ضعیف میسیلیومها می باشد و همچنین تولید بخش زیادی از میسیلیوم سفید می باشد.
این دو نمونه جداسازی شده حتی در مورد حاوی بودن ویروس 190s نیز با یکدیگر تفاوت دارند.
با اعمال کردن تست الایزا نشان داده شده که نمونه B-1 دارای مقدار بیشتری از ویروس در مقایسه با نمونهA-9 می باشد.
نشانه های بیماری که مختص هر یک از این نمونه ها می باشند می تواند شاخص قابل انتخاب برای افزایش میزان واگیری و سرایت به کار رود و می توان در تعیین نقش هر کدام از این دو ویروس در توسعه و گسترش از آن استفاده کرد.
در مطالعات قبلی سه نمونه جداسازی شده دیگر نیز به طور دقیق مورد بررسی قرار گرفت .
این نمونه ها شامل B-2 , HV408 و HW-1 هستند.
همه این نمونه ها دارای میسیلیومهای طبیعی با هاگزایی بالا روی PDA بودند.
همچنین درمورد دو نمونه HV408 و HW-1 با انجام تست الایزا , تشخیص داده شد که که آنها عاری از ویروس 190s می باشند.
بر خلاف آنها در هنگام نمونه برداری از نمونه B-2 مشاهده شد که این نمونه حاوی ویروس 190s می باشد که البته میزان آن نسبت به مقدار بدست آمده 190s از دو نمونه B-1 و A-9 , بسیار کمتر بوده است.
این نمونه همچنین دارای مقدار بسیار کمی 145s می باشد در صورتیکه در دو کلونی دیگر( B-1 و A-9 ) ,از هر دو ویروس به مقدار زیاد مشاهده شد و همچنین معلوم شد که میزان وجود 145s نسبت مستقیم با شدت بیماری دارد بنابراین علت اصلی بروز بیماری باید ویروس 145s باشد.
به هر حال نقش ویروس 190s را در تشدید بیماری تا زمانی که نمونه مبتلا به هر دو ویروس جداسازی شود نمی توان بطور واضح تشخیص داد.
در کلونی B-2 مقدار زیادی میسیلیوم هوازی تولید شد که فرو ریزی نکردند, هیفهای پیرامونی این کلونی بسیار طولانی و دراز بوده است و دارای شاخه های کمی بوده است .
سلولها دارای شکل و سایز یکسان و یکنواخت بوده و دارای محتویات سیتوپلاسم طبیعی هستند.
اما در کلونی A-9 هیفها دارای شاخه های زیادی بوده و بیشتر سلولها حالت متورم دارند و سیتوپلاسم آنها بصورت دانه دانه و غیر طبیعی می باشد, بعضی از سلولها حل شده و محتویات سیتوپلاسم آنها را در حالی که چسبیده به هیفها چسبیده اند می توان مشاهده نمود.
بخش ضخیم این سلولها نشان دهنده حضور تعداد زیادی از اجتماع ذرات ویروس مانند (VLPs ) می باشند.
در شکل بخش ضخیم سلولهای قسمت رأس همانند سلولهایی که در نوک هیفها قرار دارند نشان داده شده است که سیتوپلاسم و ارگانهای داخلی سلول فاسد شده است و تقریباً کل سلول با VLP های انباشته شده پر شده است.
قسمت ضخیم سلول در هیفهای سالم بصورت نرمال و طبیعی است و هیچ نشانی از تجمع VLP ها در آن مشاهده نمی شود.
میزان بیماریزایی نمونه های مبتلا به H.
victoriae : لیندربرگ میزان بیماریزایی این ویروس را در نمونه های سالم و بیمار دانه های یولاف از طریق دو روش تلقیح مورد آزمایش قرار داد.
این تزریق شامل پلاکهای میسیلیوم بود که در قسمت محور برگ قرار داده شده بود و یا هنگام دانه پاشی و بذر پاشی به خاک منطقه اضافه گردید.
نتیجه آن نشان داد که نمونه های جداسازی شده بیمار دارای کاهش در میزان سم و زهرآگینی خود شده اند و این در حالی است که در حدود 93 تا 100 درصد نمونه های سالم که در برابر میسیلیوم نرمال قرار گرفتند از بین رفتند و تنها 13 تا 20 درصد از گیاهانی که در معرفی میسیلیوم بیمار قرار گرفته بودند از بین رفتند.
در روش درمانی,که در مایع تزریقی, مخلوطی از میسیلیوم سالم وبیمار قرار داشت و این تزریق به خاکی که در آن دانه های کاشته شده بودند وارد شد حدود 50 درصد گیاه ها باقی ماندند هنگامیکه دانه ها را 30 روز بعد از وارد کردن این ماده به خاک کاشتند درصد گیاهانی که مورد تزریق ترکیب قرار گرفتند و زنده ماندند مساوی با آنهایی بودن که تنها در معرض میسیلیوم بیمار قرار گرفته بودند.
نتیجه آن بدین معنی بود که یک کنترل بیولوژیکی در مورد نمونه های سمی معمولی و نرمال در خاک ایجاد شده است.
میزان بیماریزایی عامل H.
victoriae بستگی به میزان تولید توکسین victorian در میزبان دارد و این عمل توسط ژنی در هسته کنترل می شود.
میزان سم نمونه های مختلف قارچها را می توان از طریق تعیین میزان توکسین تولید شده در گیاه میزبان اندازه گیری کرد.
با استفاده ازآزمون زیستی و جلوگیری از رشد ریشه , لیندربرگ اعلام کرد که تولید توکسین توسط نمونه های سالم به میزان 2 تا 10 باربیشتر از مقدار تولید شده در نمونه های بیمار بوده است.
او رابطه آن را با میزان رشد در بین دو نوع مختلف از نمونه های جداسازی شده نشان داد.
سندرلین , چندین نمونه سالم وبیمار که مبتلا به ویروس مورد نظر بودند را برای تعیین میزان توکسین مورد آزمایش قرار داد.
نتیجه آن نشان داد که وجود یا عدم وجود ویروس در گیاه نسبت مستقیم با میزان تولید توکسین ندارد و این مسئله روشن می سازد که تولید توکسین در گیاه تحت نظر ژن هسته صورت می گیرد.
با در نظر گرفتن این حقیقت که تمام نمونه های جداسازی شده بیمار, یک مقدار کمی ویکتورین تولید می کنند می توان نتیجه گیری کرد که ابتلا به ویروس می تواند به طور غیر مستقیم بر میزان تولید توکسین تأثیر داشته باشد و باید در نظر گرفت که تولید توکسین نه تنها به علت ایجاد جهش در ژن هسته صورت نمی گیرد بلکه می تواند به علت واکنشهای نوکلئوپلاسمی در قارچهای مبتلا به ویروس باشد.
این فرضیه را می توان از طریق روشهای زیر مورد تست و آزمایش قرار داد: زیر نظر داشتن و کنترل میزان تولید توکسین در نمونه HW-1 که توسط یک یا هر دو ویروس مبتلا شده است.
این نظریه که درمان و بهبود دو نمونه بیمار B-1 و A-9 باعث می شود که آنها دوباره توانایی خود را در تولید مقدار زیادی ویکتورین بدست بیاورند.
انتقال عامل H.
victoriae : گابریل و مرتاف, پروتوپلاسم را ازنمونه های فاقد ویروس جدا کردند و همراه با نمونه خالص سازی شده ویروس( دو ویروس145s و 190s ) در حضور پلی اتیلن گلوکل , عمل رقیق سازی پروتوپلاست در محیط تولید پروتوپلاسم را انجام دادند.
کلونی هایی که حاصل از پروتوپلاست دوباره تولید شده بودند به طور مجزا به PDA منتقل شدند و برای آزمایش وجود علائم بیماری مورد بررسی قرار گرفتند.
مدارک و نظریه ای که نشان می دهد که بیماری به نمونه فاقد ویروس ,با استفاده از پروتوپلاست قارچها و تولید ویروس های خالص سازی شده منتقل شده است بر اساس شرایط زیر است: با بررسی و آزمایش کلونیهای غیرطبیعی و ناقص می توان مشاهده کرد که برخی از خواص عامل H.
victoriae در بین کلونیهای مشتق شده از کلونیهایی که بر روی آنها ویروس اعمال شده است وجود دارد.
در قسمت ضخیم هیفها در کلونیهایی که اخیراً مبتلا به بیماری شده بودند وجود بافتهایی انباشته شده از VLP کاملاً آشکار و قابل مشاهده بود .
ذرات ویروس در تعداد کم و سایزهای هم اندازه برای ویروسهایی که در مایع تزریقی وجود داشتند , در میسیلیوم نیز ردیابی شد که این ردیابی با استفاده از میکروسکوپ الکترونی در کلونیهای تازه بیمار شده صورت گرفت و درآن از آنتی سرم مخلوط از ویروسهای 145s و 190s, استفاده شد.
بنابراین, بیماری از طریق پروتوپلاست قارچ ها به نمونه سالم فاقد ویروس منتقل شده است و آماده سازی ویروس های خالص سازی شده, بر اساس وجود کلونی های غیر طبیعی و دارای رشد ناقص در میان نمونه هایی که ویروس به آنها اعمال شده است می باشد.