دانلود مقاله نماتد شناسی در کشاورزی

تاریخچه

نماتدهای انگل انسان و حیوانات اهلی، سال ها توجه دانشمندان را به خود جلب کرده است.

بعضی از انگل های انسانی مثل کرم پیوک یا Guinea worm (Dracunculus medinesis) از ابتدای شروع علم پزشکی شناخته شده بود.

یکی از اولین رکوردهای مکتوب در مورد نماتدهای انگل انسان در کتاب  Papyrus Ebers  (1500B.C.)می باشد که درباره کرم روده Ascaris lumbricoides و کرم پیوک نوشته شده است Agatharchides(180 B.C.) ..این کتاب مشخصات کرم پیوک را شرح داده و اپیدمی این بیماری و نحوه معالجه آن در بین قوم یهود را بیان کرده است.

اطلاعات دقیق تر در مورد کرم های گرد و پهن را می توان  از نوشته های سقراط (400 B.C.) و ارسطو (350  B.

C.) به دست آورد.

بوعلی سینا (1000  A.

C.) معالجه کرم سوزنی (Pin worm) Enterobius vermicularis به وسیله تنقیه را توصیه کرده که هم اکنون نیز پذیرفته است (Crofton , 1968).از نمونه های مهم نماتدهای انگل حیوانی می توان کرم تریشین spiralis Trichinella رادر  ماهیچه های خوک نام برد که در سال 1846 توسط Leidy کشف شد.

نماتدهای انگل مهره داران قسمت مهمی از علوم جانورشناسی پزشکی و دامپزشکی را تشکیل می دهند که به طور کلی Parasitology نامیده می شود و شامل    Medical Helminthology وHelminthology Veterinary می باشد(Christie,1959).

لینه در سال 1758 در طبقه بندی خود بنام Systema Natura تعدادی از نماتدهای پارازیت انسان و حیوانات را در گروه Verms (کرمها) قرار داد، لیکن مطالعه علمی این دسته از

نماتدها در قرن نوزدهم صورت گرفت و منجر به پیدایش علم تازه Helminthology گردید (Thorne , 1961).

  در حالی که نماتدهای انگل مهره داران در بیشتر دوره زندگی شان در اندازه هائی هستند که به آسانی با چشم غیرمسلح دیده می شوند، نماتدهای آزاد و انگل گیاهی در اندازه های میکروسکپی می باشند.

بنابراین مطالعه و بررسی آنها بعد از اختراع میکروسکپ ،در اوائل قرن 17 میلادی شروع شد و چون نماتدها قسمت عمده فون موجودات میکروسکپی را در بسیاری از محیط های مرطوب تشکیل  می دهند طبیعتاً مورد توجه علاقه مندان و استفاده کنندگان اولیه میکروسکپ قرار گرفتند (Christie  , 1959).

اولین رکود ثبت شده درباره نماتدهای آزاد زی (Free-living,nematodes) از بورلوس Borellus در سال 1656است که اختصاص به کشف نماتد Vinegar eelworm موجود درسرکه ها دارد.

سپس Leeuwenhoek و سایر هم دوره ای هایش که با میکروسکپ کار می کردند نماتد سرکه Turbatrix aceti را نمونه جالبی برای مطالعات بیولوژیک تشخیص دادند (Thorne 1961).

مطالعه نماتدهای انگل گیاهی کم و بیش به صورت اتفاقی توسط دانشجویانی که زندگی نماتدهای آزاد را مطالعه می کردند، شروع شد و زمانی که اهمیت اقتصادی این انگل ها روی محصولات کشاورزی مشخص شد مطالعه آنها به عنوان قسمتی از علم بیماریهای گیاهی شروع گردید.

نماتد گندم Anguina tritici  اولین نماتد انگل گیاهی است که در سال 1743 کشف شد و توجه پژوهندگان اولیه علم نماتولوژی را به خود جلب کرد.

در این سال نیدهام (Turbeville ,Needham)کشیش انگلیسی دانه های گندم را که به خیال خودش آلوده به سیاهک بود باز کرد و متوجه رشته های شفاف و بی حرکتی شد و موقعی که این رشته ها را در آب قرار داد متوجه شد که حرکت می کنند.

آنچه نیدهام مطالعه کرد در حقیقت یک گال آلوده به نماتد گندم بود و رشته های بی حرکت لاروهای سن دوم این نماتد بودند که به حالت خفته (dormant) در گال قرار داشتند.

کشف نیدهام انگیزه ای برای توجه بیشتر به این موضوع و بحث های زیادی شد اما نه به خاطر اینکه یک نماتد انگل گیاهی کشف شده است، بلکه علاقه دانشمندان بیشتر متوجه این نکته بود که مشاهدات نیدهام ممکن است نوعی تولید مثل خودبخودی (Spontanous generation) باشد.

      کشف نماتدهای انگل گیاهی تا سال 1855 مشخص نشده بود تا اینکه در این سال برکلی Berkeley مشخص کرد که علت غده ای شدن ریشه های خیار روئیده شده در گلخانه های انگلستان وجود نماتد مولد غده ریشه Meloidogyne sp می باشد.

دو سال بعد کوهن (Kuhn,1857)در آلمان نماتد Ditylenchus dipsaci را که امروزه نماتد ساقه و پیاز می باشد از روی علف هرز (Teasel) Dipsacus fullonum  شناسایی کرد.

در سال 1859 شاخت (Schacht ) وجود نماتد مولد سیست چغندر قند Heterodera schachtii را کشف کرد.

اولین مقاله جامع در مورد نماتدهای آزاد توسط باستین "Bastian" در سال 1865 درباره نماتدهای خانواده Anguillulidae به چاپ رسیده است که وی در آن 100 گونه نماتد در 30 ژانر معرفی کرد و همچنین راه های جداسازی نماتدها از خاک و گیاه را مشخص نمود.

در سال 1873اتو بوچلی" Otto Butschli" اولین مشخصات مرفولوژیک نماتدهای آزاد و هم چنین خصوصیاتی را که متمایز کننده جنس های مختلف نماتدها است معرفی نمود و شاید اعتبار بنیان گذاری علم نماتولوژی گیاهی را می توان به او نسبت داد تا به باستین
 Bastian    (Thorne,1961 ).

این مطالعات و کشفیات در علوم محض (Pure science) بدون اینکه هیچ گونه انتظاری در کسب اهمیت عملی آنها وجود داشت انجام می شد.

اولین واقعه ای که نشان داد نماتدهای انگل گیاهی ممکن است از نظر اقتصادی اهمیت داشته باشند و حقیقتاً در اقتصاد کشاورزی یک مملکت تاثیر بگذارند در اواسط قرن نوزدهم به وقوع پیوست.

در آن زمان نماتد چغندرقند
H.

schchtii تهدید مهمی برای اقتصاد و تولید چغندرقند وصنایع قند اروپای مرکزی شد.

(Christie , 1959).

از اوائل قرن بیستم مطالعات وسیعی در مورد نماتدهای انگل گیاهی شروع شد و با پیدایش سمومی مثل 1,3 chloropropropene) D-D و 1,2 dichloropropane  (و EDB) Ethylen dibromide( که دارای خواص بسیار عالی نماتدکشی بوده و ضررهای نماتدکش های گازی قبلی را نداشتند، متخصصین این علم توانستند زارعان را به وجود خسارت توسط نماتدها به راحتی آشنا سازند و در نتیجه در سال 1951 دانشمندانی مثل کریستی Christie وپری Perry در فلورایدا نشان دادند که
 

نماتدهای انگل خارجی گیاهان نیز وجود دارند.

این کشف موجب شد که سایر نماتدهای موجود در خاک و هم چنین انواع مختلف ارتباط انگل و میزبان مطالعه شوند.

در سال 1958 برای اولین بار نشان داده شد که یک نماتدانگل گیاهی می تواند ناقل ویروسهای گیاهی نیز باشد.

در آمریکا اولین دانشمندی که در مورد نماتولوژی گیاهی مطالعات وسیعی انجام داد کوب N.A .Cobb است.

او در سال 1913،اولین مقاله خود را به چاپ رسانید.

وی پیشنهاد کرد که نماتدهای آزاد و انگل گیاهی باید از علم Helminthology جدا شده و در علم Nematology مطالعه شود.

به این ترتیب علم نماتولوژی گیاهی شروع شد و تا به امروز ادامه پیدا کرده است و بنا به گفته  تورنThorne در سال 1961 ،علم نماتولوژی در موقعیتی قرار گرفت که علم حشره شناسی در سال 1900 و علم بیماری های گیاهی در سال 1920 قرار داشت.

به این ترتیب علم نماتولوژی گیاهی شروع شد و تا به امروز ادامه پیدا کرده است و بنا به گفته تورنThorne در سال 1961 ،علم نماتولوژی در موقعیتی قرار گرفت که علم حشره شناسی در سال 1900 و علم بیماری های گیاهی در سال 1920 قرار داشت.

در ایران" عباس دواچی"،در سال ،1328 در کتاب" آفات مهم گیاهان زراعی و طرز مبارزه با آنها "نماتد گندم A.tritici را با نام سیاه دانه از مناطق اصفهان و کرمان گزارش کرده است (بهداد، 1358).

"قوام الدین شریف"برای اولین بار در سال 1335 ، نماتد مولد غده ریشه Meloidogyne javanica را از روی ریشه گوجه فرنگی با نام Heterodera marioni در باغ کشاورزی قصر شیرین مشاهده و گزارش کرد.

تحقیقات نماتدشناسی در ایران، عملاً از سال 1340 در موسسه تحقیقات آفات وبیماری های گیاهی توسط دکتر" مجید امیدوار"، شروع گردید (امیدوار، 1347).

با گسترش خسارت نماتد مولد غده ریشه و هم چنین پیدایش نماتد مولدسیست چغندرقند توسط اسماعیل پور و شیفر در استان خراسان در سال 1348 ، تحقیقات نماتولوژی بطور اختصاصی آغاز شد.

دکتر" احمد خیری"، با چاپ مقاله ای در بلژیک در سال 1351 ومعرفی 72 گونه نماتدهای پارازیت گیاهی از ایران(Kheiri,1972)، سهم عمده ای در پایه گذاری علم تاکسونومی نماتد هادر ایران دارد.مهندس شاپور باروتی وشادروان مهندس احمد اخیانی وخانم دکترزهرا تنهامعافی را نیز باید از پیش کسوتان تحقیقات نماتدشناسی در ایران نام برد(زمردی،1382).با افزایش تعداد محققین این علم در سراسر کشور که نمی توان نام همه آنهارا در اینجا ذکر کرد، شناسایی وپراکندگی گونه های متعدد نماتد ها و هم چنین راه های مبارزه با آنهاپیوسته در حال افزایش و پیشرفت است.تا کنون تعداد 248 گونه متعلق به 80 جنس نماتد از ایران گزارش شده است(باروتی مصاحبه خصوصی).

اهمیت اقتصادی: با وجود کوشش و سرمایه گذاری بشر برای مبارزه با آفات (Pests)، خسارت وارده به محصولات غذائی و لیفی ادامه داشته و یکی از مهم ترین عوامل اقتصادی و اجتماعی می باشد.

بدون شک نماتدهای انگل گیاهی یکی از پراکنده ترین، موذی ترین و پرهزینه ترین آفات هستند که گاهی به صورت دوره ای موجب نابودی و فلج اقتصادی محصولات می شوند.

با توجه به افز ایش جمعیت بشردر جهان و براساس آمار موجود که تا سال 2100 به 16-10 میلیارد نفر خواهد رسید، مصرف غذائی جهان افزوده خواهد شد.

علاوه بر این توزیع مواد غذائی در نقاط مختلف جهان به خاطر عوامل مختلف یکنواخت نخواهد بود و در نتیجه با وجود افزایش تولید در بسیاری از محصولات کمبود مواد غذائی وجود خواهد داشت.

علاوه بر این، بیابان ها و کویرهای روی کره زمین بارشدی معادل 28 میلیون هکتار در سال روبه رو خواهند بود که خود موجب کاهش زمینهای کشاورزی خواهد شد.

اگر میزان مصرف سرانه غذائی در سال 2000 را معادل مصرف سال 1975 در نظر بگیریم، میزان نیاز به بقولات 66% ، غلات 75% و سبزیجات 100% افزایش خواهد یافت.

(Brown and kerry , 1989).

با توجه به موارد فوق، کوشش در جلوگیری از عوامل بازدارنده تولید محصولات کشاورزی یکی از هدف های اصلی بشر می باشد و شناسائی و مبارزه با نماتدهای انگل گیاهی از این امر مستثنی نیست .

در زیر به چند نمونه از خسارت های نماتدها به محصولات عمده کشاورزی اشاره می شود.

خسارت نماتد مولدسیست چغندرقند Heterodera schachtii را در کالیفرنیا به ازاء هر عدد سیست (حدود 100 عدد تخم) در هر 75 میلی لیتر خاک خشک ،40 کیلوگرم شکر در هکتار تخمین زده اند(Heijbroek,1973).

خسارت نماتد ساقه و پیاز Ditylenchus dipsaci را در انگلستان معادل 60000 پوند در سال ویا معادل از بین رفتن محصول 1% مزارع زیر کشت گل نرگس و یا 1/0% درآمد سالانه این محصول تعیین کرده اند.

در ایالت اورگن آمریکا میزان خسارت این نماتد روی محصولات پیازی 5% محصول تعیین شده است.در سال 1999،نیزمیزان خسارت این نماتد روی محصول سیر در ایالت کالیفرنیا 25 میلیون دلار برآورد گردید(H.Ferris,internet) .

خسارت نماتد غلات Heterodera avenae را به ازاء هر 16 عدد تخم نماتد در هر گرم خاک خشک 20% کاهش محصولات گندم برآورد کرده اند و میزان زیان سالانه در اثر این نماتد را در انگلستان 2 میلیون پوند ، در دانمارک 50 میلیون کرن دانمارک و در سوئد 50 میلیون کرون سوئد، در سال 1962 برآورد کرده اند.

در آفریقای جنوبی، خسارت نماتدهای مولد غده ریشه Meloidogyne spp را به ازاء هر 10% افزایش آلودگی نماتد 45 کیلوگرم توتون در هکتار تعیین کرده اند.

در زیمبابوه در سال 1963 میزان خسارت ناشی از نماتد مولد غده ریشه روی توتون را 10 میلیون دلار در سال برآورد کرده اند و خسارت نماتدهای مولد زخم Pratylenchus spp را روی توتون در سال 1956 در ایالت کارولینای شمالی آمریکا معادل 5 میلیون دلار تخمین زده اند (Webster , 1972).

به طور کلی، تخمین میزان خسارت وارده توسط نماتدها کاری ساده نیست و نیاز به دقت زیاد دارد.

لیکن طبق آخرین اطلاعات وزارت کشاورزی آمریکا خسارت سالانه حاصل از نماتدهای انگل گیاهی را 5/8 میلیارد دلار تعیین کرده است (Sasser and Freckman,1987).

با استفاده از سموم تدخینی چند تخمین در مورد میزان خسارت نماتدها برآورد شده است.

البته افزایش میزان رشد گیاه که در اثر کنترل نماتدها حاصل شده است ممکن است در اثر افزایش قدرت گیاه عاری از نماتد در مقابله با سایر شرائط نامساعد نیز باشد.

هم چنین نماتدکشها سایر میکرو ارگانیسم های بیماری زا را نیز کنترل می کنند.

تی لر(Taylor,1962)، خلاصه 853 آزمایش اثر فومیگانها روی چندین محصول را منتشر ساخت و نشان داد که در توتون 4/13% ، گوجه فرنگی 9/72% ، پنبه 4/91% ، لوبیا روغنی 1/126% ، چغندرقند 2/175% افزایش محصول به دست آمده است.

نتایج بررسی اجمالی که توسط ساسر وفرکمن(Sasser and Freckman,1987)) از 371 نماتولوژیست در 75 کشور جهان به دست آمده است در جدول شماره 1 ارائه گردیده است : جدول شماره 1- خلاصه نتایج میزان خسارت سالیانه نماتدها به محصولات کشاورزی در مقیاس جهانی موقعیت نماتدها در طبقه بندی جانوران بعد از طبقه بندی لینه در طبقه بندی های جدید انواع مختلف کرمها در چند گروه کاملاً متمایزقرار می گیرند.

اکثر متخصصین طبقه بندی هم عقیده اند که به طور طبیعی یک گروه از بی مهرگان دارای تقارن دو جانبی (Bilateralia) هستند و چنانچه تشکیل حفره داخلی بدن (Coelom) یک وجه مشخص فیلوژنتیک باشد این گروه از بی مهره گان را می توان در سه گروه طبقه بندی کرد.

گروه اول فاقد حفره داخلی بدن Acoelomate، گروه دوم دارای حفره کاذب Pseudocoelomate و گروه سوم دارای حفره واقعی Coelmate هستند.

جانورانی که در گروه دوم قرار دارند شامل: 1- Nematoda.

2- Rotifera جانوران کوچک آبزی دارای کرونای تاژک دار شبیه پروتوزوا.

3- Gastrotricha جانورانی شبیه روتیفرا ولی فاقد کرونا.

4- Kinorhyncha جانورانی میکروسکپی فاقد تاژک با بدنی بندبند.

5- Pirapulida موجودات بزرگ استوانه ای شکل دریائی با بدنی ظاهراً بند بند.

6- Nematomorpha جانوران پارازیت حشرات شبیه نماتدها ولی فاقد سیستم دفعی.

7- Acanthocephala کرم هایی با سرخاردار (شکل 1).

خانم هایمن (Hyman,1951) نماتدها را همراه با 5 کلاس دیگر در شاخه Aschelminthes که شبیه شاخه Nemathelminthes هستند قرار داد، در حالی که چیت وود و چیت وود (Chitwood and Chitwood , 1950) نماتدها را در شاخه جداگانه ای طبقه بندی می کنند.

با وجودآنکه هنوز دلائل قطعی برای هر یک از دو طبقه بندی فوق وجود ندارد لیکن امروزه اکثر نماتولوژیستها طبق عقیده چیت وود نماتدها را در یک شاخه طبقه بندی می کنند.

در سال 1958 چیت وود (Chitwood , 1958)، نام Nemata را برای این گروه از جانوران پیشنهاد کرد.

تعریف نماتدها: نماتدها که به زبان انگلیسی به آنها eelworm (کرم های مار مانند) و در زبان یونانی nema (به معنی نخ) می گویند جانورانی پرسلولی و کرمی شکل می باشند که برعکس کرم ها بندبند نیستند.

اعضای بدن آنها طوری قرار گرفته که دارای تقارن دو طرفی می باشند (قسمت جلوی بدن آنها تقارن شعاعی دارد).

به طور کلی، نماتدها دارای اندامی دراز و استوانه ای (دارای مقطع دایره ای شکل) بوده و از لحاظ اندازه بسیار متنوع می باشند.

طول آنها از چند میلی متر تا چند متر ممکن است متغیر باشد..

نماتدهای بالغ انگل گیاهی و خاکزی بین 2/0میلی متر تا کمی بیش ازیک سانتی متر طول دارند، لیکن طول اکثر گونه ها بین 5/0 تا 5/1 میلی متر است و هم چنین معدودی گونه ها اندازه های بزرگ تر دارند.در بین نماتدهای انگل انسان و حیوانات، طول کرم معمولی روده Ascaris lumbricoides به 40 سانتی متر می رسد.

طول کرم کلیه Dioctophyme renale به بیش از یک متر و اندازه نماتد ماده Placetonema gigantissimum در بالن 5/8 متر طول با 5/2 سانتیمتر عرض می باشد(Hooper,1978).

در اکثر نماتدهای انگل گیاهی دو شکلی جنسی دیده نمی شود.

فقط، در تعدادی از جنس هایی هائی که انگل اختصاصی هستند بدن افراد ماده متورم شده و تقریباً کروی شکل و یا لیموئی شکل می شود که بهترین نمونه آنها نماتدهای مولد غده ریشه Root–knot nematodes spp; Meloidogne .

شکل 1- جانورانی که شباهت نزدیک به نماتدها دارند:A- Acanthocephala،B-Gastrotricha، C-Kinorhyncha،D- Rotifera،E- Priapulida.(Jenkins & Taylor , 1967) و نماتدهای مولدسیست Heterodera spp.;Cyst-nematodes می باشد.

از خصوصیات نماتدها، یکی وجود حفره کاذب (Pseudocoel) می باشد که از یکرف به جدار خارجی و از طرف داخل به دستگاه هاضمه محدود می گردد و فاقد دیواره مخاطی می باشد.

سایر مشخصات نماتدها این است که دیواره بدن از قشر کوتیکول تشکیل شده که مضرس و یا صاف است و در زیر آن هیپودرم (اپیدرم) قرار گرفته که دارای 4 طناب طولی (longitudinal chord) است که دسته های ماهیچه های سماتیک را از هم جدا می سازند.

از درون هر یک از این طناب های طولی، حداقل یک رشته عصبی عبور می کند.

سیستم دفعی فاقد سلولهای flame بوده اما از مجاریی تشکیل شده است که از طریق منفذ دفعی excretory pore در سطح شکمی از کوتیکول عبور کرده و به خارج باز می شود.

سوراخ مخرج و تناسلی افراد نر مشترک بوده تشکیل کلواک در سطح شکمی عقب بدن را می دهداما، سوراخ تناسلی افراد ماده از مخرج مجزا است و در سطح شکمی قرار دارد.

نماتدها فاقد سیستم تنفسی و گردش خون می باشند.

دستگاه گوارش نماتدها از دهان، (mouth) حفره دهانی (Stoma)، مری( Esophagus یا (Pharynx، دریچه مری روده (Cardia)، روده(Intestin)، دریچه انتهائی روده و مخرج(Anus) یا کلواک(Cloack) تشکیل شده است که در فصل های بعدی به طور مفصل شرح داده خواهد شد.

در اینجا اشاره می گردد که حفره دهانی یکی از متغیرترین اعضاء بدن نماتدها است و طبقه بندی بسیاری از گروههای مختلف براساس شکل حفره دهانی و تزیینات درون آن از قبیل اسپیر (spear) یا stylet، دندان (teeth) صفحات مختلف (Plates) و دندانه ها (denticles) می باشد.

بعد از دهان مری نماتدها یکی دیگر از اعضای متمایز کننده گروه های مختلف است که شامل قسمت ابتدائی مری، حباب میانی مری (دریچه حباب میانی مری) ، حباب انتهائی مری و غدد مترشحه آن می باشد (شکل 2).

یکی دیگر از خصوصیات مشخصه نماتدها وجود فشار مایع داخل بدن آنها است turger presure) )و چنانچه یک نماتد زنده را وسیله سوزن سوراخ کنیم مایع داخل بدن با فشار خارج می شود.

میزان این فشار حدود 5/0 آتمسفر بیشتر از فشار محیط اطراف می باشد که این خاصیت منحصر به نماتدها است.

محیط زندگی نماتدها: نماتدها را از نظر شرایط زندگی به شرح زیر طبقه بندی می کنند.

نماتدها اصولاً نماتدها جانوران رطوبت دوست هستند و بنابراین در تمام محیط های مرطوب یافت می شوند.نماتدهای انگل جانوران عالی بیشتر در سیستم گوارشی، جریان خون و یا اعضای داخلی وجود دارند.

بنابراین در محیط مرطوب زندگی می کنند.

بسیاری از نماتدهای انگل گیاهی درون بافت گیاهان میزبان زندگی می کنند که خود محیط مرطوبی است.

بسیاری از نماتدها در آب های شیرین، شور و خاک زندگی می کنند.

حتی نماتدهای خاک زی نیز در قطرات آب درون خاک زندگی می کنند و یا قشر نازکی آب را با کوتیکول خود حمل می نمایند.از کل نماتدهای شناخته شده حدود50% دریائی،25%خاک زی و آزاد،15%انگل جانوران از مهره داران تا حشرات و10%انگل گیاهان می باشند.

هایمن (Hyman , 1951) تعداد گونه های نماتدها را بیش از نیم میلیون تخمین زده است.

نماتدها در انواع مختلف خاک ها وجود دارند و با وجودی که بیشتر در سطح خاک زندگی می کنند تا عمق 3 متری خاک نیز ممکن است یافت شوند.

در عین حال که نماتدها Cosmopolitan بوده و از خاک های مناطق یخبندان قطب Antarctic تا مناطق استوائی از خاک استخراج شده اند لیکن بعضی از گونه ها منحصر به شرائط خاص می باشند.

مثلاً نماتدهای مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری در مناطق سردسیر نمی توانند زندگی کنند و از بین می روند و یا نماتد های مناطق تروپیک در نواحی معتدله نمی توانند به زندگی خود ادامه دهند.

فصل دوم استخراج و مطالعه نماتدها ج برای تشخیص و مطالعه نماتدها لازم است ابتدا آنها را از خاک و یا بافت گیاه جدا نمود.

برای این منظور روش های مختلفی بر حسب نوع نماتد، محیط زندگی آن و هدف مطالعه به کار گرفته می شود که به طور خلاصه سیستم استخراج به دو گروه تقسیم می شود: قیف برمن: یکی از ساده ترین روش های استخراج نماتد می باشد.

در این روش انتهای یک قیف شیشه ای را به یک لوله پلاستیکی متصل و انتهای لوله را با یک گیره می بندند.

قیف را روی یک پایه یا تکیه گاهی سوار کرده و در داخل آن مقداری آب می ریزند، سپس نمونه خاک و یا بافت خرده شده گیاهان حاوی نماتدهای متحرک را درون یک لایه دستمال کاغذی روی یک الک توری با سوراخ های ریزپهن کرده و الک را روی قیف قرار می دهند به طوری که سطح آب به انتهای الک برسد.

در این روش نماتدهای فعال از دستمال عبور کرده و پس از شنا کردن در آب در داخل لوله لاستیکی در بالای محل اتصال گیره ته نشین می گردند.

نماتدهای غیرفعال باکندی بیشتری به پائین لوله می رسند و بعضی نیز ممکن است اصلاً از دستمال عبور نکنند.

معمولاً 24 ساعت برای استخراج نماتدها کافی است و پس از سپری شدن این مدت، با باز کردن گیره متصل به لوله پلاستیکی، چند میلی لیتر از مایع درون لوله را که محتوی نماتد است درون بشر یا تشتک پتری ریخته و برای مطالعه استفاده می کنند.

یکی از معایب این روش این است که به علت فقدان اکسیژن در پائین لوله بسیاری از نماتدها می میرند و عیب دوم جدا نشدن نماتدهای غیر فعال از خاک است (شکل3 )، (Southey,1978).

شکل 3- قیف برمن، سمت چپ با استفاده از پارچه و سمت راست با استفاده از الک صافی (Southey 1986).

شکل4- وسائل مورد نیاز جهت جدا کردن نماتدها از بقایای گیاه و خاک : ظرف ته صاف حاوی صافی پارچه ای (Cotton- wool Milk filter ) که برای ضخامت بیشتردو تا شده است و روی پارچه طوری که به حلقه پلاستیکی متصل شده قرار می گیرد.

شکل 5- بشقاب استخراج نماتد: A- سینی ظهور عکاسی حدود 31×36 سانتیمتر، B- سبد توری سیمی با پوشش پلاستیک 23×33 سانتیمتر، C- توری پلاستیک با سوراخهای درشت برای نگهداری خاک، D- صافی (دستمال اغذی یک لایه، صافی شیر یا پارچه پنبه ای یا نایلون) E- یک لایه نازک خاک، F- آب به اندازه ای که سطح خاک را بپوشاند اما آنرا غرقاب نکند.( Southey 1986) .

شکل 6- استخراج نماتدها از مقادیر کم خاک یا بقایای گیاهی I بشر حاوی خاک، بشقاب پلاستیکی صافی درشت، توری نایلون که به حلقه پلی اتیلن متصل شده و الک را تشکیل می دهد.

II خاک آماده شده برای استخراج روی الک III نماتدهای استخراج شده از بقایای گیاهی، IV صافی درشت و توری نایلون با بزرگنمائی نشان داده شده است (Southey 1986).

سینی وایت هد: روش تغییر یافته قیف برمن است.

در این روش برای جلوگیری از کشته شدن نماتدها در اثر فقدان اکسیژن از یک سینی لبه دار (معمولاً سینی های ظهور عکاسی) و یا بشقاب های بزرگ لبه دار استفاده کرده و درون آن یک توری سیمی یا سبد پلاستیکی که محافظ خاک باشد قرار می دهند.

درون سبد یک لایه توری پنجره پلاستیکی قرار داده و روی آن یک لایه دستمال کاغذی پهن می کنند.

مقدار 250 میلی لیتر خاک را که معمولاً ریگ و بقایای گیاهی آنها را جدا کرده اند به آرامی روی دستمال کاغذی پهن می کنند ودرون سینی به آرامی آب می ریزندتا اینکه سطح آب به لایه دستمال کاغذی برسد.

این سینی را مدت 72-24 ساعت به حال خود در یک محل کاملا افقی می گذارند به طوری که نماتدها از خاک خارج شده و از دستمال عبور کرده وارد آب درون سینی می شوند.

سپس سبد پلاستیکی حاوی خاک را به آرامی از درون سینی خارج کرده و آب درون سینی را که حاوی نماتدها می باشد درون یک بشر 600 سی سی تا یک لیتری ریخته و حداقل مدت 6 ساعت بدون حرکت نگهداری کرده تا این که نماتدها در ظرف ته نشین شوند.

سپس آب اضافی ظرف را به وسیله لوله پلاستیکی سیفون کرده و خارج می کنیم .

حدود 100 سی سی آب باقی ماند ه در ظرف، حاوی نماتدها است که برای مطالعه آماده می باشد(اشکال4و 5و6).

(Whitehead & Heming , 1965) روش الک ها Cobb decanting &sieving برای شناسائی انواع نماتدهای موجود در یک خاک می توان از چندین الک با اندازه های مختلف (1 میلی متر، 710، 250، 150، 90 و 63 میکرن)(درجدول2 مقایسه اندازه الکهای مختلف ارایه شده است) که روی هم قرار می گیرند استفاده نمود و نماتدهای هر یک از الک ها را جداگانه جمع آوری نمود.

برای این کار خاک را درون یک ظرف دهانه گشاد ریخته و روی آن آب می ریزند و بهم زده تا اینکه ریگ و ذرات درشت آن ته نشین شود و با بهم زدن با دست کلوخه ها را نیز خرد می کنند و مدت 30-40 ثانیه صبر کرده و مخلوط آب و خاک را روی الک 1 میلی متر ریخته و گل ته ظرف را جدا می کنند.

آب خارج شده از الک 1 میلی متر را روی الک بعدی ریخته و نماتدهای با اندازه های مختلف جدا می گردد.

برای استخراج کامل، این عمل دوبار تکرار می شود (Cobb,1918.(شکل 7).

جدول 2- اندازه الکها بر اساس استاندارد انگلستان(B.S.410:1962).

شکل 7- طبقات الک بااندازه مختلف که برای جدا کردن نماتدها از خاک که به صورت سوسپانسیون در آب در آمده است به کار می رود (شماره روی الک ها نشان گر اندازه ا الک برحسب مش "Mesh" می باشد).

نماتدها و بقایای گیاهی که روی هر الک جمع آوری می شود درون ظرفهای پائین عکس جمع آوری می شود.

(Southey 1986).

روش الک سانتری فوژ در این روش مقدار 250 میلی لیتر خاک را از روی یک الک که اندازه سوراخ های آن حدود 840 میکرن (20 مش) باشد، داخل یک طشتک یا سطل که حدود 6 لیتر حجم داشته باشد می شوئیم و سپس سطل را پر از آب کرده و خوب بهم می زنیم و مدت حدود 30-40 ثانیه صبر می کنیم که شن و ماسه و ذرات درشت خاک ته نشین گردد.

سپس محلول داخل سطل را روی دو الک 210 میکرن (72 مش) و 38 میکرن (400 مش) می ریزیم (الک اول به منظور جدا کردن ریشه و سایر مواد سبک همراه مایع می باشد).

سطل را دو مرتبه پر از آب کرده و این عمل را تکرار می کنیم.

محتوی الک 38 میکرن را با مورب نگهداشتن الک و پاشیدن آرام آب به پشت آن در کنار الک جمع کرده و سپس داخل یک بشر 250 میلی لیتری می ریزیم.

محتوی بشر را در یک یا دو لوله 50 میلی لیتری سانتری فوژ ریخته و آنرا به مدت 10-5 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه می چرخانیم (در این مرحله چنانچه سرعت یا زمان بیشتر هم بشود اشکالی ندارد).

پس از نگهداشتن سانتری فوژ، مایع بالای لوله سانتری فوژ را دور ریخته و بجای آن محلول شکر با وزن مخصوص g/cm3 18/1 (453 گرم در یک لیتر آب) اضافه می کنیم و با مواد ته نشین شده لوله خوب مخلوط می نمائیم و دو مرتبه آن را به مدت 1- 5/0 دقیقه سانتری فوژ می کنیم (در این مرحله بهتر است سانتری فوژ را روشن کرده هم اینکه سرعت آن به 3000 دور در دقیقه رسید خاموش می کنیم).

پس از این کار مایع روی قسمت ته نشین شده را که حاوی نماتدها می باشد روی الک 38 میکرن یا ریزتر می ریزیم.

البته بهتر است الک را داخل یک ظرف آب قرار دهیم که بلافاصله نماتدها شسته شوند و از پلاسمو لیزه شدن آنها جلوگیری شود.

نماتدهای جمع آوری شده روی الک را درون یک بشر می شوئیم.

این محلول آماده بررسی می باشد.

برای استخراج نماتدها درون ریشه نیز می توان از همین روش استفاده کرد و فقط در قسمت اول ریشه ها را درون مخلوط کن (blender) خرد کرده و روی الک ها می ریزیم.

(Jenkins, 1964) روش میستی فایرMistifier extraction technique این روش بیشتر جهت استخراج نماتد های مهاجر داخلی در بافت های گیاهی به کار برده می شود.هم چنین برای استخراج نماتدها در مدت طولانی مانند استخراج تخم نماتدها نیز به کار می رود.ازمحاسن این روش رسیدن اکسیژن کافی به نماتدها وهم چنین شسته شدن مواد شیره گیاهی و مواد حاصل از تجزیه مواد گیاهی می باشد .

برای این کار چندین قیف برمن را که قطعات خرد شده گیاهی آلوده به نماتد را درون آنها گذارده اند در زیر نازل هایی که آب را به مقدار 4.5 لیتر در ثانیه به صورت مه می پاشند قرار می دهند.مقدار فشار اب 2.8kg/cm2 می باشد.

انتهای هر یک از قیف ها درون لوله آزمایش با دهانه حدود 5/.2 سانتیمتر و یا بشرهایی با ارتفاع بلند قرار می گیرد به طوری که نماتدهای استخراج شده در ته لوله باقیمانده و آب اضافی سرریز می گردد.پس از گذشت زمان لازم که بستگی به نوع بررسی دارد(معمولا1-5روز)نماتد های درون لوله های آزمایش را شمارش می کنند.زمان پاشیدن آب نیز متغیر بوده و بین هر 10-5 دقیقه ، 15-10 ثانیه می باشد (Seinhorst,1950)، (عکس 1).

رنگ آمیزی نماتدها درون بافت های گیاهی: جهت بررسی ویا شمارش نماتدها درون بافت های گیاهی به خصوص ریشه بایستی آنهارا رنگ آمیزی کرد تا بهتر رویت شوند.برای این کار ابتدا اندام های گیاهی را به آرامی با آب می شویند که ذرات خاک و مواد اضافی آنها شسته شود .

جهت بی رنگ کردن بافت های گیاهی می توان آنهارا در هیپوکلریت سدیم (5.25%NaOClیا وایتکس)به مدت 4 دقیقه قرارداده وسپس آنهارا خوب با آب شستشو داده تا اثر وایتکس از بین برود.

سپس آنهارا در قطعات کوچک خرد کرده و مقدار 5 گرم ان را انتخاب و درون محلول لاکتوگلیسیرین+اسید فوشین (اسید لاکتیک 87.5ml،گلیسیرین6.3ml،آب مقطر6.2ml،اسید فوشین0.01گرم)فرو برده ومدت 30 ثانیه در میکرویو آون جوشانده ویا روی چراغ الکلی و یا شعله گاز در زیر هود آزمایشگاهی حرارت داده تا اینکه محلول شروع به جوشیدن کند.بر حسب نوع گیاه پس از 5-3 دقیقه گیاهان را خارج نموده و با آب شست وشو داده تا رنگ اضافی شسته شود.در این صورت نماتدها به رنگ قرمز دیده می شوند.( (Hooper et al, 2005.

کشتن و ثابت کردن نماتدها: قبل از اینکه به توان نماتدها را زیر میکرسکب بررسی کرد بایستی آنها را کشت و ثابت کرد.

معمولاً ،نماتدها را می توان با حرارت تا حدود 65 درجه سانیتگراد در آب کشت و سپس با اضافه کردن مواد ثابت کننده (fixative) ثابت کرد.

محلول 10-5 درصد فرمالین معمولاً برای ثابت کردن و نگهداری نماتدها به کار می رود.

نماتدهائی که در این ماده نگهداری می شود معمولاً تیره رنگ می شوند.

ماده فیکساتیو دیگری به نام TAF (فرمالین(فرمالدهید40%) ml7 ، تری اتانول آمین ml2 و آب مقطر ml91) دارای این مزیت است که نماتدهای ثابت شده به وسیله آن تا چندین سال ظاهر طبیعی و زنده خود را حفظ می کنند.

ساین هورست( (Seinhorst , 1966 یکی از بهترین روش های کشتن و ثابت کردن نماتدها را در یک مرحله ارائه کرده است.

در این روش نماتدها را پس از استخراج در مقدار کمی آب درون یک شیشه ساعت و یا بشر کوچک قرار داده و سپس مایع فیکساتیو F.A.4:1 (فرمالین یا فرمالدئید %40 ، ml10 ,اسید استیک خالص ml1 و آب مقطر ml89) را که تا دمای جوشان حدود 100-80 درجه سانتیگراد رسیده باشد روی آن اضافه می کنند.

هم چنین می توان از فیکساتیو TAF (فرمالینml7, تری اتانول امینml2, آب مقطرml91 )نیز استفاده نمود.در این فیکساتیو ظاهر نماتد ها برای سال ها ثابت می ماند.

از نماتدهای ثابت شده می توان در ماده لاکتوفنول (فنول ml50 ، اسیدلاکتیک ml50 ، گلسیرین ml100 ، آب مقطر ml50) اسلاید نیمه موقت تهیه کرد و زیر میکروسکپ به مطالعه آنها پرداخت.