مقدمه خون بافتی است که از 2 قسمت سلول ها و مایع تشکیل شده است.
سلول ها عبارتند از گلبول های قرمز داریتروسیت ها، گلبول های سفید (کلوسیت ها) و پلاکت ها مایع خون را پلاسما گویند که حدوداً از 90 درصد آب و 10 درصد مواد جامد محلول در آن تشکیل شده است.
پلاسما شامل مواد پروتئینی، الکترولیت ها (مانند سدیم، پتاسیم، کلسیم، بیکربنات و …) قند، کلسترول، اسیدهای چرب، فسفولیپیدها، آنزیم ها و غیره می باشند.
اعمال مختلف خون در بدن عبارتند از: 1- حمل اکسیژن به بافت ها و خارج کردن دی اکسید کربن از آنها 2- حمل مواد غذایی به بافت ها 3- انتقال فرآورده های متابولیسمی برای دفع به کلیه ها، کبد، ریه، روده، پوست 4- تنظیم آب داخل و خارج سلولی 5- تنظیم حرارت بدن با انتشار خون در بافت ها 6- توزیع هورمون ها و سایر مواد 7- دفاع بدن و ایجاد ایمنی خون به عنوان یک بافت با اعمال فوق دارای ویژگی هایی است که آن را از سایر بافتها متمایز کند.
هنگامی که خون کامل دارای ماده ضد انعقاد سانتریفوژ می شود، فضایی که به وسیله گلبول های قرمز فشرده شده اشغال می شود، اصطلاحاً هماتوکریت نام دارد و به صورت درصد گلبول های قرمز خون نسبت به خون کامل بیان می شود.
به عبارت دیگر هماتوکریت یک نمونه خون، نسبت حجم گلبول های قرمز به حجم کل خون است .
همچنین هماتوکریت به عنوان PCV یا حجم گلبول های قرمز فشرده شده شناخته شده است مقادیر هماتوکریت کاملاً به موازات مقادیر و تعداد گلبولهای قرمز خون است.
مقادیر نرمال هماتوکریت همانند هموگلوبین و تعداد گلبول های قرمز خون تحت تأثیر عوامل مختلفی مانند سن، جنس، نژاد و محیط و … قرار می گیرد.
روش های خون گیری از ماهی: 2 روش کلی خون گیری در ماهیان است: 1) روش خون گیری مکرر از یک ماهی Serial Blood Sampliny 2) فقط یک بار خون گیری Once Only Sampling روش خون گیری مکرر به دلیل استرس ناشی از خون گیری کمتر استفاده می شود لذا محققان روش فقط یک بار خون گیری را توصیه می کنند.
زمانی که زنده بودن ماهی پس از خون گیری مهم نباشد می توان ماهی را کشت به 3 طریق: 1- یک ضربه محکم و سریع را با استفاده از یک شی فلزی دسته اسکالپر، به ناحیه اتصال جمجمه و ستون مهره ها در ناحیه سر وارد کنیم.
در این حالت نخاع قطع شده و منجر به مرگ می شود.
2- نخاع را قطع کنیم و با فرو کردن و حرکت جانبی تیغه اسکالپر در محل اتصال جمجمه به اولین مهره ستون فقرات در ناحیه سر با یک حرکت افقی 3- استفاده از مواد بیهوش کننده با غلظت بیش از غلظت لازم برای بیهوشی در صورتی که بخواهیم ماهی زنده بماند پودر Ms 222 را به نسبت خاص برای ماهی مورد نظر حل کرده ماهی ها را یکی یکی درون محلول گذاشته و پس از 2 دقیقه بیهوش می شوند ماهی را خشک کرده از پهلو روی میز گذاشته از بالای ساقه دمی باز اولیه 45 درجه در کنار خط جانبی وارد عضله شده وقتی سرنگ به ستون مهره جاندار رسید با بازی در آن به رگ های این قسمت رسیده و با کشیدن پیستون سرنگ مقدار خون مورد نیاز به دست می آید.
یا از انتهای باله مخرجی در قسمت ساقه دمی و از قسمت شکمی ماهی به صورت عمودی سوزن را وارد عضله ماهی کرده و وقتی بر ستون مهره رسید (به شبکه رگ های این قسمت) با کشیدن پیستون سرنگ ؟؟؟
تأمین می شود (جمالزاده، 1380) از نواحی مختلف می توان خون گیری کرد: - قطع ساقه دهی در ماهی کوچک - در ماهیان بزرگ تر خون را می توان با استفاده از آئورت پشتی یا Dosal aortic puncture آئورت شکمی –قلب به دست می آید.
زمانی که ماهی ما ارزش داشته باشد و زنده ماندن آن مهم باشد و ولش لوله گذاری Canultion مطرح است که مانند قرار دادن یک 3 راهی لوله ای نازک در وسط جریان خون است.
که برای ماهیان بزرگ تر استفاده شود.
سر لوله گره زده می شود و هر وقت نیاز باشد خون از این منطقه برداشته می شود.
(محل قرارگیری 3 راهی لوله ای نازک کمان آبششی رگ های آوران – وابران است) بهترین نتایج از تلفیق روش های کشتن ماهی Stunning به همراه استفاده از ماده ضد انعقاد مپارین و نگه داری نمونه خون گرفته شده در سرما و سرعت عمل در انجام مراحل حاصل می شود.
مواد و روش کار: ماهی از خانواده Cyprinidae (کپور-ماهی حوض) قیچی خط کش خواندن هماتوکریت سانترینوژ هماتوکریت خمیر هماتوکریت (موم) Cristoseal لوله هماتوکریت هماتوکریت را ممکن است مستقیماً به وسیله سانتریفوژ و به روش های ماکرو یا Wintrobe و نیتروب و میکروهماتوکریت اندازه گیری کنند یا به صورت غیر مستقیم توسط دستگاه های اتوماتیک و از حاصل ضرب MCV در شمارش گلبول های قرمز به دست آورند.
روش و نیتروب در گذشته استفاده زیادی داشت ولی امروزه به علت زیاد بودن خون مورد نیاز، مدت زمان طولانی سانتریفوژ و زیاد بودن پلاسمای به دام افتاده در لابه لای گلبول های قرمز کاربرد کمی دارد.
روش میکرو هماتوکریت Microhatocrit در این روش از لوله های میکروهماتوکریت با طول تقریباً 7 سانتی متر و قلمرو یک میلی متر استفاده شود در انتهای لوله های میکروهماتوکریت یک حلقه رنگی وجود دارد.
در لوله های میکروهماتوکریت فاقد ضد انعقاد، حلقه آبی و رنگ و در لوله های میکروهماتوکریت آغشته به ماده ضد انعقاد هپارین، حلقه قرمز رنگ یافت می شود.
لوله های اخیر را با هپارین که به نسبت یک به 1000 رقیق شده است پر کرده و سپس در حرارت 56 تا 37 درجه سانتی گراد خشک می کنند اگر از خون دارای ماده ضد انعقاد استفاده می شد باید لوله های آبی رنگ استفاده شود ولی چنانچه از خون مویرگی استفاده می شود از لوله های میکروهماتوکریت با حلقه قرمز رنگ استفاده شود.
سانتریفوژ میکروهماتوکریت دارای حوزه سانتریفوژی 10000 تا 15000 است که پس از روشن شدن در عرض 3 ثانیه به حداکثر سرعت می رسد.
در روش میکرو، لوله های مو ئینه مدرج نیستند در این روش باید ارتفاع ستون خون را که شامل پلاسما گلبول های قرمز است با خط کش میلی متری مخصوص یا صفحه مدرج مخصوص میکروهماتوکریت، قرائت کرد.
اینجا * 1- ماهی را قطع ساقه دمی کرده لوله هپارینه را در تماس با خون قرار می دهیم لوله میکروهماتوکریت را به طوری که حباب مواد ایجاد نشود پر می کنیم.
2- انتهای خشک لوله میکروهماتوکریت را در وضعیت عمودی در خمیر هماتوکریت فرو کرده تا در حدود 6-4 میلی متر از انتهای لوله از خمیر پر شود.
در حین عمل نباید به خون موجود در لوله فشار وارد شود.
3- دو لوله هماتوکریت را در شیارهای شعاعی سانتریفوژ، به طوری که در وضعیت مخالف و روبروی یکدیگر باشند قرار داده انتهای بسته لوله ها باید به طرف خارج صفحه سانتریفوژ قرار داشته باشد.
4- به مدت 5 دقیقه دستگاه را به کار بیاندازید با استاندارد 7000 rpm 5- به محض اینکه سانتریفوژ متوقف شد لوله های میکروهماتوکریت را از آن خارج کرده و با استفاده از خط کش یا جدول مدرج مخصوص، هماتوکریت را برحسب درصد قرائت می نمائیم اختلاف 2 لوله هماتوکریت باید در حدود درصد باشد در غیر این صورت باید آزمایش تکرار شود.
(عامری 1378) نتایج: هنگامی که خون کاملاً سانتریفوژ می شود گلبول های قرمز به علت وزن مخصوص زیادتری که نسبت به سایر عناصر خونی دارند در ته لوله قرار می گیرند به طوری که به ترتیب از سر لوله به پایین طبقاتی به شرح زیر ایجاد می شود: 1- پلاسما: طبقه زرد رنگ 2- لایه بافی کوت (Buffy coot): طبقه خاکستری مایل به قرمز شامل: الف- ترمبوسیت ها: طبقه رویی به رنگ کرم ب- مکوسیت ها: طبقه خاکستری قرمز رنگ ب- مکوسیت ها: طبقه خاکستری قرمز رنگ ج- گلبول های قرمز هسته دار که در لایه بافی کوت در صورت وجود ایجاد رنگ قرمز می کنند.
3- طبقه گلبول های قرمز (عامری 1378) برای خواندن میزان هماتوکریت ها با خط کش هماتوکریت: لوله هماتوکریت را در شیار خط کش هماتوکریت قرار داده و انتهای پایین ستون گلبول های قرمز را با خط صفر تنظیم کرده سپس خط سفید متحرک میانی را با سطح بالای گلبولهای قرمز تنظیم و درصد حجم گلبولهای قرمز را از روی ستون مندرج می خوانیم.
میزان Hc+ در ماهیان بالغ بیشتر از نابالغ است.
(جمالزاده 1380) این در آزمایش هماتوکریت به ترتیب زیر است: (1979) Smeda , Hooston .
(1979) Millich 8 Catlett در مطالعات حجم خون پلاسما را 8/2 و 3 درصد محاسبه نموده اند.
حجم خون ماهیان نسبت به سایر مهره داران کمتر است.
در ماهیان اسلاموبرانش این میزان بین 6-8 میلی بیتر به ازاء 100 گرم و در استخوانی بین 2-4 میلی لیتر به ازاء 100 گرم است.
میزان هماتوکریت را با درصد نشان می دهند.
معمولاً در ماهیان اسلاموبرانش (آبشش صفحه ای ها) میزان هماتوکریت کمتر از 25 درصد است.
در ماهیان استخوانی این میزان بین 10 تا 30 درصد متغیر است.
در کپور معمولی حدود 27 درصد است.
درماهیان دریایی فعال مثل تن ماهیان یا Thunnus بالاترین میزان هماتوکریت که حدوداً بیش از 50 درصد است مشاهده شده است.
(هماتوکریت انسانی 45 درصد).
میزان هماتوکریت و به تبع آن هموگلوبین با توجه به عواملی چون گونه، فصل، دما، وضعیت تغذیه و بهداشت ماهی متفاوت است در برخی گونه های وجود تغییرات شبانه روزی هم گزارش شده است.
یکی از عوامل تغییر هماتوکریت ماهیان تنظیم فشار اسمزی است.
در صورت عدم تنظیم فشار اسمزی در ماهیان آب شیرین به دلیل ورود بیش از حد آب به بدن خون این ماهیان رقیق شده و همودیلیشن از آب شیرین به شور بالا می رود.
و Hct کاهش می یابد.
در ماهیان آب شور به دلیل خروج آب از بدن خون غلیظ شده و Hemoconcentration و Hct و هماتوکریت، آن بیشتر می شود به نظر می رسد Hct ماهیان دریایی از این نظر بیش از ماهیان آب شیرین است.
بحث: 1- سرعت و مدت کافی برای سانتریفوژ کردن شروط اساسی در به دست آوردن یک هماتوکریت صحیح است گلبول های قرمز توسط سانتریفوژ کردن باید آنقدر فشرده شوند که با سانتریفوژ کردن بیشتر حجم گلبول های قرمز متراکم، کاهش پیدا نکند.
2- اگر انتهای لوله های میکروهماتوکریت به طور ناقص بسته شود باعث کاهش کاذب نتایج خواهد شد.
3- عدم سانتریفوژ کافی و همچنین ماندن لوله ها به مدت بیشتر از 10 دقیقه پس از اینکه سانتریفوژ متوقف شد باعث افزایش کاذب نتایج خواهد شد.
4- اگر مقدار ماده ضد انعقاد بیش از حد نیاز باشد به علت چروکیده شدن گلبول های قرمز خون باعث کاهی کاذب خواهد شد.
5- در حین عمل سانتریفوژ کردن، بخش کوچکی از گلبول های سفید، پلاکت ها و پلاسما در میان گلبول های قرمز به دام می افتند که خطای ناشی از آن اهمیت چندانی ندارد.
افزایش هماتوکریت حامل از پلاسمای به دام افتاده (Trapped Plasma) گاهی بیشتر از هماتوکریت حاصل از گلبول های سفید و پلاکتهای به دام افتاده است کاهش نیروی سانتریفوژ باعث افزایش مقدار پلاسمای به دام افتاده در میان گلبولهای قرمز می شود و همچنین مقدار آن در روش هاکر و بیش از میکرو است.
در روش میکرو هماتوکریت، پلاسمای به دام افتاده حدود یک تا 3 درصد کل ستون گلبول های قرمز متراکم می باشد.
6- به علت کمتر بودن زمان سانتریفوژ و نیز خطای ناشی از پلاسمای به دام افتاده روش میکرو هماتوکریت بر روش ماکرو ارجحیت دارد و به عنوان روش مرجع توسط کیته بین المللی استاندارد کردن هماتولوژی (ICSH) توصیه شده است.
میزان خطای این روش 2-1 درصد است.
7- برای به دست آوردن نتایج صحیح نمونه ها باید در سرما نگهداری شوند.
8- در هنگام قرائت Hc+ باید بالاترین حد لایه گلبول های قرمز خوانده شود این مطلب زمانی که تعداد گلبول های سفید یا پلاکت ها افزایش شدید دارد دارای اهمیت فراوان است.
(عامری 1378) 9- مقدار هماتوکریت به اندازه تعداد گلبولهای سرخ و همچنین حجم پلاسما بستگی دارد اگر مقدار آن بیش از اندازه طبیعی باشد می تواند نمودار افزایش گویچه ها یا کاهش حجم پلاسما باشد.
- اگر مقدار هماتوکریت کمتر از حد طبیعی باشد ممکن است به دلیل کاهش تعداد گویچه های قرمز یا افزایش حجم پلاسما باشد (کم خونی- انسانی) 10- از آنجایی که هموگلوبین معمولاً حجم گلبول قرمز را اشغال می کند میتوان با تقسیم کردن PCV بر عدد 3 مقدار تقریبی Hd را برحسب گرم در دسی لیتر به دست آمد.
و با توجه به اینکه PCV بستگی کامل به اندازه و مقدار گلبولهای قرمز موجود در واحد خون دارد می توان از تقسیم کردن PCV به عدد 6 مقدار تقریبی گلبول های قرمز را در یک میلی مترمکعب خون بر حسب میلیون به دست آورد.
(عامری 1378) تهیه گسترش خون (Blood Smear Preparation) بررسی گسترش خونی بخش مهمی از ارزیابی هماتولوژی را تشکیل می دهد.
قابل اعتماد بودن اطلاعات به دست آمده از بررسی گسترش خونی، بستگی زیاد به تهیه و رنگ آمیزی خوب گسترش ها دارد.
در اینجا سه روش برای تهیه گسترش های خون شرح داده می شود که عبارتند از: روش گسترش روی لام ( Slide Film) یا روش دو لامی یا روش گوه ای (The two slide or wedge method) روش گسترش روی لامل (Cover glass method) و روش خودکار یا چرخشی (Spinner method).
دو روش اضافه بر روش های فوق برای تهیه‌گسترش های خون در برخی موارد مورد استفاده قرار می گیرند.
یکی از این موارد تهیه گسترش از لایه بافی کوت (Buffy coat) در لوله های میکروهماتوکریت است و هنگامی مورد استفاده قرار می گیرد که تعداد گلبول های سفید خون به شدت کاهش یافته است و این روش باعث تغلیظ سلول های هسته دار خون می گردد.
روش دیگر تهیه گسترش ضخیم خون (Thick blood smear) است که معمولاً برای جستجوی انگل های خونی انجام می شود.
پس از تهیه‌گسترش خون، رنگ آمیزی های عمومی یا اختصاصی انجام شده و بررسی مرفولوژی سلول های خونی و شمارش افتراقی گلبول های سفید بر روی آن صورت می گیرد.
1- روش تهیه گسترش بر روی لام یا روش دو لامی یا گوه ای دو عدد لام شیشه ای تمیز انتخاب کنید (لام هایی که برای تهیه گسترش خون به کار می روند باید کاملاً سالم و عاری از هر گونه آلودگی و غبار باشند (چنانچه این لام ها قبلاً مورد استفاده قرار گرفته اند باید ابتدا در الکل 95 درصد قرار داده و با پارچه تمیز کاملاً خشک شوند).
2- از یکی از دو لام به عنوان لام پخش کننده استفاده کنید.
3- حتی المقدور گسترش خون را باید از خون تازه ای که به آن ماده ضد انعقاد افزوده نشده است تهیه کرد.
چنانچه از خون دارای ماده ضد انعقاد استفاده می کنید باید در اسرع وقت نسبت به تهیه گسترش اقدام کنید.
4- به وسیله لوله میکروهماتوکریت یک قطره کوچک از خون مخلوط شده را در یک سانتی متری لبه لام قرار دهید.
5- لام را بر روی یک سطح صاف قرار دهید، در حالی که قطره خون در طرف راست شما قرار دارد (برای افراد چپ دست بهتر است در سمت چپ قرار گیرد).
6- توسط انگشت نشانه و شست دست چپ دو طرف لام را نگه دارید و لام پخش کننده را طوری در دست راست بگیرید که لام بین انگشت شست و چهار انگشت دیگر قرار گیرد (تصویر شماره 15).
7- انتهای لام پخش کننده را کمی جلوتر از قطره خون قرار دهید، به طوری که بین دو لام زاویه تقریباً 30 تا 45 درجه ایجاد شود.
8- لام پخش کننده را کمی به عقب بکشید تا با قطره خون تماس پیدا کند و خون در لبه لام به طور یکنواخت پخش گردد.
چنانچه خون در سرتاسر لبه لام پخش نشد مقداری لام پخش کننده را حرکت دهید تا این خون در سرتاسر لبه لام پخش شود.
دقت کنید که خون به قسمت جلوی لام پخش کننده سرایت نکند.
9- لام پخش کننده را با یک حرکت یکنواخت و ملایم در سطح لام دیگر حرکت دهید تا یک لایه نازک از خون به دست آید.
10- با تکان دادن گسترش در جریان هوا گسترش را به سرعت خشک کنید.
گسترش را نباید به حرارت یا دمیدن به آن خشک کرد.
11- گسترش را می توان با نوشتن مشخصات بیمار نشانه گذاری کرد.
نوشتن مشخصات توسط قلم الماس روی انتهای لام یا توسط مداد بر روی انتهای ضخیم گسترش خونی انجام می شود.
2- روش تهیه گسترش بر روی لامل 1- برای این روش، لامل های نمره 1 یا 5/1 (مربع به اضلاع 22 میلیمتر) توصیه می شود.
لامل ها باید کاملاً تمیز باشند.
2- یکی از لامل ها را توسط دو گوشه آن بین انگشت شست و انگشت نشانه قرار دهید.
3- یک قطره کوچک خون به قطر 2 تا 3 میلیمتر در مرکز لامل قرار دهید.
4- با دست دیگر یک لامل را مثل لامل اول نگه دارید.
5- به آرامی لامل دوم را روی لامل اول که حاوی یک قطره خون است به صورت ضربدری قرار دهید، به طوری که قطره خون بین دو لامل دوم روی لامل اول قرار گیرد خون بین آن دو پخش می شود.
6- قبل از آنکه خون کاملاً بین دو لامل پخش شود، دو لامل را با یک حرکت سریع، ناگهانی، افقی و در دو جهت مخالف بکشید.
دقت کنید که لامل دوم را نباید از روی لامل اول بلند کرد زیرا حفراتی در گسترش باقی خواهد ماند.
همچنین باید از فشار دادن دو لامل بر روی یکدیگر خودداری شود.
7- هر دو لامل را به صورتی که سطح گسترش رو به بالا قرار گیرد، روی کاغذ تمیزی قرار دهید تا در مجاورت هوا خشک شوند.
بحث: 1- در گسترش روی لامل توزیع سلول ها اتفاقی تر از گسترش روی لام است ولی به علت کوچک و شکننده بودن لامل، فن و رنگ آمیزی گسترش بر روی لامل برای افراد مبتدی مشکل است.
2- به محض اینکه قطره خون روی لامل اول قرار می گیرد باید بدون تأخیر لامل دوم روی آن قرار گیرد.
اگر قطره خون بیشتر از 5-3 ثانیه بماند، توده شدن پلاکت ها و گلبول های سفید و قرمز و پدیده رولو در گلبول های قرمز ایجاد می شود.
3- قرار دادن قطره بزرگ خون باعث ضخیم شدن گسترش تهیه شده می گردد.
4- یک روش اصلاح شده تهیه گسترش بر روی لامل به این ترتیب است که به جای یکی از لامل ها از یک لامل شیشه ای استفاده می شود.
در این روش یک قطره خون در مرکز لام شیشه ای قرار دهید و در حالی که لامل بین دو انگشت شست و نشانه قرار دارد آن را روی قطره خون بر روی لام شیشه ای قرار دهید و قبل از اینکه پخش شدن خوب کامل شود، لامل را از لام به وسیله یک حرکت سریع جدا کنید در نتیجه گسترشی که بر روی لام ایجاد می گردد همانند گسترشی است که بر روی لامل ایجاد می شود.
3- روش تهیه گسترش اتوماتیک یا چرخشی تهیه گسترش های خون به این روش، محاسن انجام ساده تهیه گسترش به روش روی لام و توزیع یکنواخت سلول ها به روش لامل را با هم دارد و به وسیله انواع خاصی از سانتریوفوژ به نام اسپینر (Spinner) انجام می شود.
در این دستگاه یک لام شیشه ای تمیز روی یک صفحه پلاتین قرار گرفته و در حدود 2/0 میلی لیتر خون حاوی EDTA در مرکز لام گذاشته می شود.
سپس دستگاه روشن و موتور به کار می افتد و در یک زمان مشخص یک گسترش یک لایه ای بر روی کل سطح لام ایجاد می شود.
دستگاه های پیشرفته تر اسپینر مجهز به سیستم نوری هستند.
در این نوع دستگاه ها دسته ای از نور از لام به یک دستگاه حساس برخورد می کند و در زمانی که سطح لام به میزان کافی از خون پر شد، دستگاه حساس آن را تشخیص داده و صفحه پلاتینی به طور خودکار از حرکت باز می ایستد.
در این روش خون بر اساس هماتوکریت بیمار بر روی لام پخش می شود.
در این روش گسترش به گونه ای ایجاد می شود که سلول ها از هم جدا بوده و هیچ کدام روی هم قرار نمی گیرند و گلبول های سفید را می توان به راحتی در هر نقطه از گسترش تشخیص داد.
گسترش ها باید در هوا خشک شوند (عامری 1378) مرحله بعد تثبیت است که به 3 روش انجام می شود: استفاده زا عبور گسترش ها 3-4 مرتبه روی شعله و توجه نمی شود.
2) استفاده از الکل 5 دقیق 3) استفاده از محلول 50 درصد الکل فرمالین 1 دقیقه رنگ آمیزی به 3 روش روش عمودی 1- Romanowsky method جهت رنگ کردن چربی ها 2- Sudan Black B جهت رنگ کربوهیدرات ها 3- Periodic Acid Schiff (PAS) روش 2 و3 اختصاص ماهی ها هستند.
روش Romanowsky: تهیه و خشک کردن گسترش ها در هوا 2- تثبیت در متانل 5 دقیقه 3- قرار دادن در رنگ Commercial leishman stain مدت 2 دقیقه 4- شستشوی کامل در آب 5- رنگ آمیزی با محلول Commercial Bfferd Gimsa 2 دقیقه 6- شستشو در بافی فسفات از مولار با PH 4/6 و سپس آب مقطر 7- خشک کردن در هوا در این روش سیتوپلاسم قرمز و هسته به رنگ آبی تیره و بنفش دیده می شود.
2- روش سودان بلک B: 1- تهیه و خشک کردن گسترش ها در هوا 2- تثبیت در فیکاتیو 10 میلی لیتر فرمالین و 90 میلی لیتر اتانل به مدت 5 ثانیه 3- شستشو در آب جاری به مدت 10 دقیقه 4- خشک کردن در هوا 5- رنگ آبزی با سودان بلک B به مدت 30-60 دقیقه دمای اتاق 6- شستشو در اتانل 70 درصد 7-رنگ آمیزی به صورت lightly ملایم و سریع با Commercial Bufferd Gimsa مشابه روش رومانوسکی در نتیجه این روش چربی ها در سلول ها به رنگ سیاه و سایر ساختمان به رنگ خاکستری روشن می شود.
3- روش PAS: 1- تهیه و خشک کردن گسترش ها در هوا 2- تثبیت در فیکاتیو فرمالین – اتانل به مدت 10 دقیقه 3- شستشو در آب جاری به مدت 10 دقیقه 4- رنگ آمیزی با Commercial Periodic به مدت 20 دقیقه 5- شستشو با آب شیر 6- غوطه ور کردن گسترش ها در Commercial Schiff reagent 20 دقیقه 7- شستشو و رنگ آمیزی با Commercial hemato yliue lightly 8- شستشو و خشک کردن در هوا در نتیجه این رنگ آمیزی در صورت مثبت بودن PAS رنگ قرمز تیره یا Rich magenta قرمز فلفلی یا بنفش ظاهر می شود که البته درجه بروز رنگ متفاوت است.
بحث در روش گسترش با 2 لامل 1- به محض قرار گیری قطره خون بر روی لام و بدون هیچ تأخیری باید گسترش تهیه شود هر گونه تأخیر باعث توزیع غیر طبیعی گلبول های سفید شود به طوری که در انتهای نازک گسترش ها تجمع حاصل می کنند.
و ممکن است گلبول های قرمز تولید حالت رولو کنند و پلاکت ها تجمع یابند.
2- ضخامت بستگی به اندازه قطره خون، زاویه بین 2 لام و سرعت حرکت لام پخش کننده بر روی لام دیگر دارد.
در یک سرعت معین افزایش زاویه لام پخش کنند باعث افزایش ضخامت گسترش خواهد شد.
3- گسترش نباید تمام سطح را بپوشاند در گسترش خوب یک قسمت ضخیم یک قسمت نازک یک قسمت تغییر تدریجی از ضخیم به نازک وجود دارد.
4- گسترش ما باید ظاهری صاف و هموار داشته و هیچ گونه برآمدگی و موج فرو رفتگی نداشته باشند.
5- در هنگام نشانه گذاری از خودکار نباید استفاده کرد.
6- به محض تهیه گسترش در جریان هوا خشک شود دیر خشک شدن سبب تجمع سلول ها و دندانه دار شدن اریتروسیت ها می شود.
بحث در روش 2 لامل: 1- در گسترش روی لامل توزیع سلول ها اتفاقی تر از گسترش روی لام است ولی به علت کوچک و شکننده بودن لامل، فن و رنگ آمیزی گسترش بر روی لامل برای افراد مبتدی مشکل است.
2- به محض قرار دادن قطره خونی روی لامل باید لامل دوم قرار گیرد زیرا بیشتر ماندن قطره خون سبب توده شدن پلاکت ها و گلبول های سفید و قرمز می شود.
مقدمه خون نوعی بافت همبند است که ماده بنیادی آن پلاسما و رشته های آن فیبرین و عناصر سلولی آن گلبول های قرمز و سفید و ترومبوسیت ها و پلاکت ها می باشد.
تعیین فاکتورهای خونی و توجه به تغییرات گلبول های قرمز و سفید همواره به عنوان یک شاخص مهم در تشخیص بسیاری از بیماریها بوده است.
ماهیانی که دارای سرعت حرکت بیشتری هستند هموگلوبین و گلبول های قرمز بیشتری دارند در حالی که گلبول های سفید آنها نسبت به ماهیان کم تحرک کمتر است.
هیپوکسی روی مقادیر پارامترهای خونی ماهیان تأثیر می گذارد به طوری که کاهش اکسیژن محیط موجب افزایش تعداد گلبول های قرمز و مقادیر هموگلوبین می گردد.
همچنین افزایش دما بر روی ماهیان کپور، حوض، سرگنده، نقره ای و روی رشد و پارامترهای خونی آنها تأثیر داشته به طوری که موجب افزایش تعداد گلبول های قرمز و موجب افزایش رشد شود.
در مطالعاتی که روی Sea bass انجام شده دریافتند که تعداد گلبولهای قرمز و هموگلوبین تغییرات فصلی معنی داری را در رابطه با تغییرات فصل و سیکل جنسی و سایر مواد فیزیولوژیک نشان می دهد.
بعضی محققان اشاره کرده اند که حجم خون در بین کل ماهیان به صورت فیلو ژنیک کاهش می یابد.
ماهیان استخوانی عالی تر دارای سیستم و دستگاه عروقی کامل تری هستند و به خون کمتری برای انتقال اکسیژن و سایر مواد نیاز دارند.
خون از 2 قسمت سرم یا پلاسما و گلبول ها و سلول های خونی تشکیل شده است.
پلاسما شامل مواد پروتئینی، الکترولیت ها، قند، چربی و … می باشد.
و سلول های خونی عبارتند از: گلبول های قرمز دار یتروسیت ها، گلبول های سفید (لکوسیت ها) و پلاکت ها (عامری 1378).
گلبول های قرمز یا ارتیروسیت ها: گلبول های قرمز ماهیان دارای یک هسته مدور یا بیضی شکل در مرکز بوده و عموماً سیتوپلاسم آنها به رنگ های ارغوانی- مسی، صورتی – مسی و یا آبی کمرنگ دیده می شوند و به هنگام رنگ آمیزی با گیمسا به سبب وجود هموگلوبین به رنگ صورتی یا مایل به زرد در می آیند.
مقدار اریتروسیت ها در ماهیان مختلف بسته به جنس، سن و فصل و شرایط محیطی با هم تفاوت زیادی داردند.
مثلاً جنس های مختلف fundulus که ساکن آبهای لب شورند دارای گلبولهای قرمز کوچکتر نسبت به گونه های مشابه شان در آب شیرین می باشند نقش عمده گلبولهای قرمز و انتقال و حمل اکسیژن است و در ماهیان به علت وجود هسته از کارایی آن نسبت به پستانداران که گلبول های قرمز آنها فاقا هسته می باشند، کاسته می شود.
(شاهسونی 1377) ترومبوسیت ها (پلاکت ها): Thrombocytes مانند پلاکت های خونی پستانداران هستند و نقش آنها نیز در انعقاد خون است این سلول ها بیضوی یا روی شکل باز و ائدسیتوپلاسمی که در هر یک از دو انتهای سلول وجود دارند قابل تشخیص هستند این سلول ها دارای مقدار کمی سیتوپلاسم و هسته ای بیضی شکل و بزرگ با شبکه کروماتین دانه دار مشاهده می شوند.
(جمالزاده 1380) محلول های رقیق کننده Diluting fluids در شمارش سلول های خونی به وسیله هموسیترمتر یا دستگاه های اتوماتیک از محلول استفاده می شود که در عین رقیق کردن خون، ایزوتونیک بوده و بر مورفولوژی سلول ها تأثیر نامطلوب نداشته باشد و در حالی که سلول های مورد شمارش را حفظ می کند سایر سلول های خونی را لیز کند.
محلول هندریکس (1952) Hendricks جهت شمارش گلبول قرمز ماهی: 1- ترکیبات محلولی با این نام جهت رقیق کردن گلبول قرمز: Na2soy ……..logr Nael ………..1.5 gr Nacitrate………..
1.5 gr Glacial acetic acid ……….
50ml Distilles water…………..to 500 ml 2- محلول Dacie (1973) Daisley & Blaxhall خطرناک40% Formaldelyde solution……………..
10ml Trisodium Citrate ……………… 31/3 gl Brilliant Cresylblue………..lgr Distilled water …………..to Ilit لام هموسیتوقر 3 دسته‌اند: لام‌های فوش رزنتال لام‌های توما لام‌های نئوبار لام‌های نئوبار اصلاح شده لام مخصوص شمارش سلولهای خونی (Counting Chamber) لام هموسیتومتر (Hemocytometer) لام‌های مدرج که برای شمارش گلبولهای قرمز، سفید یا پلاکت‌ها ساخته‌شده‌اند هموسیتومتر نامیده می‌شوند.
این وسیله برای شمارش دستی سلولهای خونی به کار می‌رود و در انواع مختلف ساخته شده است.
متداول‌ترین آنها لام شیشه‌ای بسیار ضخیمی است که حاوی دو حجره مخصوص شمارش می‌باشد (Double Counting Chamber).
مدل‌های مختلفی از این لام وجود دارند که هر یک مصارف خاصی دارند و از میان آنها میتوان به دستگاه آدیس (Addis) برای آزمایش ادرار و دستگاه پتروف – هوزر (Petroff - Hauser) برای شمارش باکتری اشاره کرد.
ولی لام نئوبار (Neubauer) که در هماتولوژی به کار می‌رود برای شمارش سلولهای خونی بوده و رایج‌ترین نوع آن لام نئوبار تکمیل شده (Improved Neubauer) می‌باشد.
لام نئوبار تکمیل شده (Improved Neubauer) این لام حاوی دو حجره (Chamber) مخصوص شمارش است که هر یک توسط خطوط متقاطع موازی به مربع‌های کوچکتری تقسیم شده است.
مجموع مربع‌های هر حجره به ابعاد کلی 3*3*1/0 میلیمتر می‌باشند که حجمی برابربا 9/0 میلیمتر را تشکیل می‌دهند.
سطح حجره به 9 مربع مساوی تقسیم شده که هر یک حجمی برابر 1/0 میلیمتر مکعب را ایجاد می‌کند.
مربع مرکزی که برای شمارش گلبول قرمز مورد استفاده قرار می‌گیرد توسط خطوط موازی به 25 مربع کوچکتر تقسیم شده است که هر یک حجمی به ابعاد 2/0 * 2/0 * 1/0 را بوجود می‌آورند که برابر 004/0 میلیمتر مکعب است.
چهار مربع گوشه‌ای برای شمارش گلبولهای سفید به کار می‌روند و هر کدام از 16 مربع کوچکتر به وجود آمده‌اند که ابعاد هر یک 25/0* 25/0*1/0 می‌باشد و در نتیجه هر مربع کوچک حجمی برابر 00625/0 میلیمتر مکعب به وجود می‌آورد.
لام نئوبار تکمیل شده مدل Spencer – Brigh هموسیتومتر انتخابی در بسیاری از آزمایشگاه‌ها می‌باشد.
این لام بیشتر برای شمارش گلبولهای قرمز و سفید به کار می‌رود ولی از آن میتوان در شمارش ائوزینوفیل، پلاکت، اسپرم و شمارش سلول مایع مغزی – نخاعی (CSF) استفاده کرد.
موارد استفاده دیگر آن شامل شمارش آدیس (Addis Count)، شمارش مخمرها (Yeast) یا استاندارد کردن واکسن‌ها به روش شمارش سلولی است.
برای شمارش دقیق گلبول‌ها باید از هر دو حجره لام نئوبار استفاده کرد و اگر اختلاف شمارش دو حجره بیشتر از باشد شمارش دقیق نبوده و باید تکرار گردد.
در شمارش سلولی گلبول‌هایی را که کاملاً در داخل مربع می‌باشند به اضافه سلولهای منطبق با دو ضلع از چهار ضلع مربع مربوط شمارش می‌کنند و از سلول‌هایی که روی دو ضلع دیگر قرار گرفته‌اند صرف‌نظر می‌شود.
ج – پی‌پت‌های شمارش سلولهای خونی (Blood Counting Pipettes) پی‌پت‌های مخصوصی برای شمارش گلبولهای خون ساخته شده است که برای رقیق کردن خون به میزان معین به کار می‌روند (Diluting Pipettes).
از میان آنها پی‌پت نوع توما (Thoma) متداول است زیرا موجب سهولت و تسریع در شمارش گلبولی می‌گردد.
پی‌پت گلبول قرمز (RBC Pipette) این پی‌پت دارای درجات 5/0، 1 و 101 می‌باشد که بین درجه 1 و 101 حباب نسبتاً بزرگی تعبیه شده است و گلوله قرمز رنگی در داخل آن قرار دارد.
برای استفاده از این پی‌پت آن را تا درجه 5/0 از خون پر کرده و بقیه آن را تا درجه 101 از محلول رقیق کننده پر می‌کنند.
در نتیجه محلولی از خون با رقت به دست می‌آید.
در کم خونی (Anemia) میتوان پی‌پت را تا درجه 1 از خون پر کرد که در این صورت رقت به دست آمده خواهد بود.
با این پی‌پت همچنین میتوان پلاکت‌ها و گلبولهای سفید را در لکوسیتوز شدید ویا لوسمی‌ها (Leukemia) شمارش کرد.