دانلود تحقیق ضرورت انجماد تخمک و جنین

با توجه به پیشرفت‌های شگرفی که در علم کرایوبیولوژی صورت گرفته بشر توانسته از روش‌های متنوع آن در نگهداری سلول‌های جنسی و جنین بهره ببرد.

اکنون با انجماد جنین، کمک شایانی به افراد نابارور شده است.

ولی موفقیت در انجماد تخمک با توجه به شرایط خاص سلول و حساسیت بیش از حد آن نسبت به شوک‌های حرارتی و برودتی بسیار پایین بوده است.

تا به حال گزارشات کمی در ارتباط با انجماد موفق تخمک انسان به دست آمده است.

اما ضرورت انجماد تخمک به دلایلی مانند سندرم تحریک بیش از حد تخمدانی (هیپراستیمولاسیون تخمدان)، ابتلاء فرد به سرطان به خصوص در سنین جوانی، نبود موفقیت مرحله اول انتقال جنین در رحم، و تقاضای والدین برای فرزند دیگر در سال‌های آتی و حتی حفظ گونه‌های کمیاب جانوری برکسی پوشیده نیست و کم و بیش نیاز آن احساس می‌شود.

سه روش عمده در انجماد تخمک مطرح است: روش آهسته، شیشه‌ای و فوق سریع.

در هر سه روش محققان تلاش می‌کنند با کاهش میزان تشکیل کریستال یخ داخل و خارج سلولی در انجماد و ذوب، قدرت حیاتی تخمک را افزایش دهند.

دو فاکتور اساسی در این امر دخالت دارد یکی استفاده از ضد یخ که باعث خروج سریع آب داخل سلولی می‌شود و دیگری سرعت انجماد که برای هر سلول متفاوت است و بستگی به نفوذ پذیری غشاء، نسبت سطح به حجم سلول و درجه حرارت دارد.

تحقیقات نشان می‌دهد که به علت نبود اطلاعات کافی در ارتباط با تأثیر انواع ضد یخ بر تخمک و صدمات وارد شده به آن، میزان موفقیت پایین است.

در روش انجماد آهسته، ضد یخ‌های نفوذپذیر با غلظت در حدود 5/1 مول به کار گرفته می‌شوند.

بنابراین، لازم است سرعت انجماد به گونه‌ای تنظیم شود که فرصت لازم برای خروج آب از سلول در اختیار آن قرار گیرد.

این روش،‌برای اولین بار به وسیله Whithingham و همکارانش در 1972 مطرح شد.

آنان، جنین دو سلولی موش را با موفقیت منجمد کرده و سالم بازیافت کردند.

تاکنون، پیشرفت‌های چشمگیری در انجماد جنین حاصل شده است و به شکل مستمر از آن استفاده می‌شود، بر خلاف تلاش‌های زیادی که جهت بهبود انجماد تخمک در گونه‌های مختلف جانوری به روش آهسته صورت گرفته است این روش نتوانسته کمک شایانی به افراد تحت درمان نازایی داشته باشد.

هم اکنون جهت ساده کردن روش انجماد از انجماد شیشه‌ای استفاده می‌کنند و نتایج بدست آمده از این روش مشخص کرده که روش مناسب تری در مقایسه با روش آهسته است.

در روش اخیر، به علت استفاده از غلظت بالای ضد یخ حدود (40%) و کوتاهی زمان آب گیری (زمان تعادل) آب بسرعت از سلول خارج شده و در حین انجماد، محیط اطراف سلول به یکباره تبدیل به شیشه می‌شود.

اولین بار این روش در 1937 به وسیله Luyet مطرح شد و اکنون در نگهداری جنین و تخمک گونه‌های مختلف جانوری به کار گرفته می‌شود.

در انجماد شیشه‌ای دو نکته حائز اهمیت، انتخاب ضد یخ و غلظت مناسب آن است.

انتخاب این دو فاکتور باید به گونه‌ای باشد که اولاً کریستال یخ داخل و خارج سلول شکل نگیرد ثانیاً غلظت به کار گرفته شده برای سلول کشنده نباشد.

محلول‌های انجماد شیشه‌ای معمولاً حاوی ضد یخ‌های نفوذ پذیر (مثل گلیسرول، اتیلن گلیکول، 1 و 2 پروپاندیول)، دی ساکارید‌های کوچک (مثل ساکارز، تری هالز، گلوکز) و ماکرومولکول‌ها (مثل پروپیلن گلیکول، فیکول 70، آلبومین سرم گاوی) می‌باشند.

نتایج محققان نشان می‌دهد، به کارگیری روش‌های یاد شده به همراه ضد یخ‌های نفوذ پذیر و نفوذ ناپذیر اثرات متفاوتی را بر تخمک گذاشته و حتی اعمال یک روش واحد برای انجماد تخمک یک گونه نیز نتایج متناقضی دارد.

به کارگیری ضدیخ‌های مختلف به تنهایی و یا در فرایند انجماد، می‌تواند اثرات زیادی را بر فراساختمان‌ سلول داشته باشد.

از حساس ترین ساختار، نسبت به تغییرات شدید برودتی، حرارتی و یا غلظت‌های مختلف ضد یخ می‌توان اسکلت سلول، میتوکندری و قشر شفاف را نام برد.

از آنجا که بسیاری از فعالیتهای مهم سلول از جمله، جابجایی کروموزومها طی تقسیم و سیتوکنزیس وابسته به عناصر اسکلت سلول می‌باشند هر گونه بهم خوردگی در این بخش‌ها تاثیر زیادی را بر تکوین تخمک و جنین‌های به دست آمده دارند.

از شایعترین این حوادث وقوع ناهنجاری کروموزومی در جنین‌های به دست آمده از تخمک‌های منجمد شده می‌باشد حتی سختی قشر شفاف که در اثر تغییر ماهیت بیوشیمیایی آن بوقوع می‌پیوندد بطور مستقیم در نفوذ اسپرم به تخمک و لقاح آن تاثیر منفی می‌گذارد و باعث کاهش قدرت لقاح آن می‌شود.

انجماد آهسته تخمک و جنین روش انجماد آهسته، برای اولین بار به وسیله Whithingham و همکارانش در 1972 مطرح شد.

او از روش جهت انجماد جنین دو سلولی موش استفاده کرد و توانست با موفقیت زیاد جنین‌های دو سلولی را پس از ذوب سالم به دست آورد.

او در این تجربه از روش انجماد و ذوب آهسته استفاده کرد.

از آن پس پیشرفت‌های چشمگیری در انجماد جنین به دست آمد، تا جایی که این روش به شکل روزمره درآمد.

هم زمان با انجماد جنین، تلاش‌های زیادی در جهت انجماد آزمایشگاههای مختلف جانوری به روش آهسته صورت گرفت که نتایج آن کاملاً ضد و نقیض IVF تخمک گونه‌های است.

محققان با بررسی فاکتورهای مختلف، سعی کردند روش انجماد آهسته تخمک را بهبود بخشند.

از مهمترین فاکتورهای مورد بررسی می‌توان به موارد زیر اشاره کرد: شناخت ساختار تاثیر سرعت انجماد به روش آهسته (سرعتی کمتر از تخمک c/minْ1) و به روش سریع.

تاثیر القای یخ زدگی در برودت نزدیک cْ7- در موفقیت انجماد تخمک نقش انواع ضد یخ در انجماد تخمک بررس روش‌های مختلف ذوب و خروج ضد یخ از تخمک بررسی خصوصیات فیزیک و شیمیایی غشای تخمک در مراحل انجماد اساس انجماد آهسته مراحل انجماد آهسته تخمک عبارتست از: آب گیری تخمک با استفاده از ترکیب حاوی ضد یخ و به تعادل رساندن آنها.

سرد کردن تخمک تا برودت زیر صفر درجه سانتی گراد القای یخ زدگی یا seeding در برودت نزدیک cْ7- و تشکیل کریستال یخ خارج سلولی.

نگهداری در ازت مایع (cْ196-) ذوب تخمک و رقیق کردن محیط به منظور خارج ساختن ضد یخ از سلول در مراحل انجماد و ذوب ساختمان سلولی، تخمک باید حفظ شود و صدمات وارد شده به سلول در اثر تشکیل کریستال‌های یخ داخلی سلولی، به حداقل برسد.

بنابراین، پیش از انجماد و یا در مرحله سرد شدن تخمک باید آب داخل سلولی را خارج کرد و میزان آن را به حداقل رسانید.

اگر این عمل به روش مناسب و کافی صورت نگیرد، کریستال‌های یخ درون سلولی شکل شده و باعث نابودی تخمک می‌شوند.

آب درون سلولی را می‌توان به چند روش خارج کرد.

با استفاده از محلول غلیظ ضد یخ.

با القای یخ زدگی که باعث تشکیل کریستال‌های یخ خارج سلولی می‌شود.

در این حالت به علت کم شدن مقدار زیادی از آب خارج سلول دراثر تشکیل کریستال یخ، محیط اطراف تخمک غلیظ تر شده و غلظت نمک‌ها و املاح افزایش می‌یابد که خود کمک موثری در خروج آب از سلول می‌کند.

یادآوری می‌شود، روش‌های ذوب متفاوتی به کار گرفته می‌شود از جمله، روش آهسته و روش سریع.

نتایج محققان نشان می دهد که انتخاب روش ذوب سریع درصد زنده ماندن تخمک ها را پس از ذوب افزایش می‌دهد.

زیرا در عمل ذوب اگر سرعت ذوب آهسته باشد، زمان کافی در اختیار کریستال‌های یخ قرار می‌گیرد و کریستال‌های بزرگ یخ به وجود می‌آید که این امر سبب صدمات زیادی به تخمک‌ می‌شود.

در مجموع از مهم ترین فاکتورهایی که در سلامت تخمک پس از انجماد تاثیر دارند می‌توان، گونه و نژاد جانور، مرحله تکامل تخمک، ضد یخ بکار گرفته شده، روش انجماد، سرعت انجماد، روش ذوب و سرعت ذوب را نام برد.

حفظ سلول در برودت زیر صفر درجه سانتی گراد در انجماد و ذوب سلول دو مرحله حساس وجود دارد که می‌تواند مخرب نیز باشد.

یکی در شروع انجماد و در مراحل سرد کردن سلول و دیگری در زمان ذوب آن است.

اگر سلول‌ها در برودت خیلی زیاد نگهداری شوند قدرت حیاتی خود را می‌توانند تا مدت طولانی حفظ کنند.

برودت آب به شکل کریستال یا شبیه به شیشه درمی‌آید و هیچ واکنشی وابسته به حرارت در این سیستم آبی انجام پذیر نیست.

اما، اگر سلول در cْ80- نگهداری شود به مرور زمان قدرت حیاتی خود را از دست می‌دهد.

تنها نکته قابل توجه در انجماد گامت و یا جنین در cْ196- این است که اسیدهای دی اکسی ریبونوکلئیک یا DNA سلول ممکن است تحت تشعشعات ازت مایع دچار شکست شوند.

هنگامی که سلول در برودت cْ5- تا cْ15- قرار می‌گیرد ابتدا کریستال‌های یخ خارج سلولی شکل می‌گیرند و اگر غشاء، مانع از ورود کریستال‌های یخ خارج سلول به داخل سلول نشود، کریستال یخ به وجود نخواهد آمد.

زمانی که غشای سلول نسبت به آب نفوذپذیر باشد ولی نسبت به یخ غیر قابل نفوذ باشد آب از سلول خارج می‌شود.

زیرا که پتانسیل شیمیایی داخل سلول از پتانسیل شیمیایی خارج سلول بیشتر است.

خروج آب از سلول باعث تغلیظ محتویات سلول می‌شود و به مرور پتانسیل شیمیایی آن را کاهش می‌دهد و آب خارج شده از سلول نیز منجمد می‌شود.

زمانی که سلول به آرامی سرد و سپس منجمد شود، پدیده خروج آب از سلول باعث کاهش تفاوت پتانسیل شیمیایی دو سوی غشاء می‌شود و اگر سلول بسرعت سرد شود به علت نبود زمان کافی برای خروج آب از سلول و برقراری تعادل بین دو سوی غشاء محتویات داخل سلول دچار فراسرما (supercooling) می‌شوند و کریستال‌های یخ تشکیل شده در سلول باعث بر هم خوردن تعادل شیمیایی در درجه حرارت بالای cْ15- می‌شوند.

زمانی که یک محلول منجمد می‌شود، غلظت مایع باقی مانده افزایش می‌یابد.

به عنوان مثال، زمانی که محلولی تا cْ10– سرد شود غلظت الکترولیت‌های محلول 20 برابر افزایش می‌یابد.

لازم به یادآوری است.

رابطه مستقیمی بین غلظت نمک و مرگ سلولی در طی انجماد وجود دارد، lovelock مشخص کرد اگر غلظت الکترولیت داخل و خارج سلول افزایش یابد غشای سلول بر هم خورده و باعث مرگ سلول می‌شود.

مشکل یاد شده که در اثر تغییرات غلظت محیط صدمات زیادی بر سلول وارد می‌آورد را با عنوان solution effects یا تاثیرات محیط می‌شناسند.

سرعت انجماد انجماد یک سیستم آبی، تغییرات زیادی را به دنبال دارد.

با کاهش درجه حرارت، کریستال‌های یخ شکل می‌گیرند و غلظت مایع افزایش پیدا می‌کند و در مجموع حجم محلول کاهش می‌یابد.

بعضی نمک‌های موجود در محلول، به حالت اشباع درآمده و رسوب می‌کنند و اگر گاز باشند به شکل حباب درمی‌آیند.

به عبارتی، کلیه پارامترهایی که وابسته به PH یا اسمولاریته هستند دچار تغییر می‌شوند.

برای هر سلول سرعت انجماد مناسبی وجود دارد، این سرعت انجماد از چند فاکتور اثر می‌پذیرد.

به عنوان مثال، حداکثر سرعت انجماد تخمک موش 2000 برابر کمتر از سرعت انجماد گلبول قرمز می‌باشد.

Mazur و همکارانش نشان دادند که اگر تخمک موش با سرعت c/minْ2 یا کمتر منجمد شود درون سلول، یخ شکل نمی‌گیرد.

اما، اگر تخمک با سرعت c/minْ4 یا بیشتر منجمد شود درون سلول کریستال یخ شکل می‌گیرد.

علت این امر، وجود آب موجود در سلول است که در حین عبور تخمک از نقطه انجماد تبدیل به کریستال یخ می‌شود.

به جهت بزرگ بودن تخمک از نقطه انجماد تبدیل به کریستال یخ می‌شود.

به جهت بزرگ بودن تخمک پستانداران موفقیت در انجماد آنها بسیار پایین بوده و در مراحل انجماد صدمات اجتناب ناپذیری بر آنها وارد می‌شود.

Mazur در 1963 با استفاده از محاسبات ریاضی، فرمولی جهت تعیین سرعت انجماد هر سلول پیشنهاد و بعدها آن را تکمیل کرد.

او اعلام کرد، مهمترین فاکتوری که در نحوه پاسخگویی سلول‌ها به انجماد اثر دارد خصوصیات غشای سلول می‌باشد، در شرایط اسمزی و حرارتی متفاوت نفوذپذیری غشای تخمک به آب، نمک‌ها و ترکیبات دیگر، تغییر می‌کند.

در مجموع، Mazur فاکتورهای زیر را در تعیین سرعت انجماد تخمک یا هر نوع سلول موثر می‌داند که باید در آبگیری و آبدهی به آن توجه داشت: ترکیب و ساختار غشاء و نفوذ پذیری آن نسبت سطح سلول به حجم آن درجه حرارت تفاوت فشار اسمزی دو سوی غشاء فرمول پیشنهادی Mazur به این قرار است : V = حجم آب سلول t = زمان K = نفوذ پذیری غشای سلول به آب A = سطح سلول R= ثابت گازها T = درجه حرارت V1= حجم مولی آب Pe= فشار بخار خارج سلول Pi = فشار بخار داخل سلول بعدها Leibo و همکارانش در 1978 با استفاده از مشاهدات مستقیم خود از تخمک لقاح نیافته موش که در شرایط کنترل شده منجمد شده بود (با استفاده از یک مول دی متیل سولفوکساید) فرمول Mazur را تأیید کردند.

برای تعیین شرایط اپتیمم سرعت انجماد هر سلول، لازم است که اطلاعاتی راجع به سرعت آب گیری سلول و برودتی که در آن کریستال یخ درون سلول شکل می‌گیرد را به دست آوریم.

به عنوان مثال، Mazur و همکارانش مشخص کردند که تخمک تقریباً 90 درصد از آب خود را باید از دست بدهد تا به برودتی برسد که شانسی برای انجماد داخل سلولی داشته باشد در حالی که یک جنین باید تقریباً 30% از آب خود را از دست بدهد تا درون آن منجمد شود.

Wood ,Rosenbergو Mazur با محاسبات کالریمتری نشان دادند حدود 90 درصد از آب درون سلول‌هایی مثل مخمر یا Escherichia توانایی منجمد شدن را دارند و 10درصد به شکل یخ نزده و متصل به دیگر ملکولها (bound water) باقی می‌مانند.

پس برای جلوگیری از صدمات ناشی از وجود کریستال یخ داخل سلول،باید پیش از رسیدن به برودت مناسب برای شکل گیری یخ آب انجماد پذیر freezable water سلول را از آن خارج کرد.

ضد یخ Cryoprotectant اصلی ترین علت استفاده از ضد یخ در انجماد سلولی جلوگیری از تشکیل کریستال یخ داخل سلولی است.

در صورت عدم به کارگیری ضد یخ، جهت آبگیری، مجبور به استفاده از محلول‌های غلیظ نمکی هستیم.

در روش‌های مرسوم انجمادی از یک یا چند ضد یخ، استفاده می‌شود.

ضدیخ را می‌توان به دو گروه عمده تقسم نمود: الف) ضد یخ‌های نفوذ پذیر یا داخل سلولی (prentraling agents) ب ) ضد یخ‌های نفوذناپذیر یا خارج سلولی (non penertrating agents) ضد یخ‌های نفوذ پذیر ضد یخ‌های نفوذ پذیر شامل گلیسرول، دی متیل سولفاکسید DMSO=Dimethyl(Solphoxide)، اتیلن گلیکول (EG=Elthylene Glycol) و 1 و 2 پروپاندیول (PROH=Propandial) می‌باشند.

این ترکیبات جرم ملکولی کمتر از 100 کیلو دالتون دارند.

گلیسرول ابتدا گلیسرول به عنوان ضد یخ در نگهداری اسپرم استفاده می‌شد و بعدها برای انجماد جنین و تخمک پستانداران به کار گرفته شد.

گلیسرول معمولاً در غلظتی در حدود 2-1 مول به کار گرفته می‌شود.

میزان سمیت گلیسرول برای سلول بستگی به حرارتی دارد که این ترکیب مورد استفاده قرار می‌گیرد.

هر چه برودت بیشتر باشد سمیت آن کمتر است مثلاً در صفر درجه سانتی گراد سمیت بیشتری در مقایسه با cّْ20-دارد.

دی متیل سولفاکسید (DMSO) دی متیل سولفاکسید مانند گلیسرول وزن مولکولی کم داشته و غیر الکترولیت می‌باشد.

تقریباً حدود 40 سال از به کارگیری آن در انجماد سلول‌ها می‌گذرد.

به ویژه پس از استفاده Whithingham و همکارانش در 1972 میزان سمیت این ترکیب در مقایسه با گلیسرول خیلی بیشتر است و با کاهش درجه حرارت از سمیت آن کاسته نمی‌شود.

البته در صفر درجه سانتی گراد نفوذ پذیری آن در مقایسه با درجه حرارت آزمایشگاه بیشتر است.

پروپیلین گلیکول (1 و 2 پروپاندیول PROH) این ضد یخ، برای اولین بار به وسیله Polge و همکارانش در 1949 به کار گرفته شد در مقایسه با DMSO ، پروپیلین گلیکول سمیت کمتری را در درجه حرارت اتاق دارد.

از این ترکیب در انجماد تخمک و جنین انسان استفاده شده و نتایج خوبی به دست آمده است.

اتیل گلیکول اتیل گلیکول در صفر درجه سانتی گراد و cْ20 در مقایسه با DMSO سمیت کمتری دارد.

استفاده از این ترکیب برای انجماد آهسته جنین و تخمک انسان تا به حال گزارش نشده است.

اما، برای انجماد جنین موش و گاو در روش انجماد و ذوب آهسته به کار رفته است.

ضد یخ‌های نفوذ ناپذیر گروهی از ضد یخ‌ها به علت بزرگی و بار الکتریکی که دارند در خارج از سلول باقی می‌مانند.

اغلب این ضد یخ‌ها، ملکول‌های قندی بزرگی مثل ساکارز، فیکول و رافیوز و یا پروتئین‌ها و لیپوپروتئین‌ها می‌باشند.

البته می‌توان از ترکیبات دیگر مانند پلاک‌های زرده‌ای تخم، شیر و سرم خون به همراه ضد یخ‌های دیگر استفاده کرد زیرا این ترکیبات حاوی قندهای سنگین یاد شده می‌باشند.

اولین بار از ضد یخ نفوذ ناپذیر در انجماد، به وسیله Kassai و همکارانش استفاده شد.

محققان از منوساکاریدهایی مانند گلوکز، دی ساکاریدهایی مانند ساکارز و تری هالوز و تری ساکاریدهایی مانند رافینوز استفاده کردند.

این ضد یخ‌ها به روش‌های مختلف باعث محافظت سلول در مراحل انجماد می‌شوند.

ترکیبات یاد شده وارد سلول نمی‌شوند اما به خروج آب از سلول پیش از انجماد کمک می‌کنند.

همچنین پس از انجماد در زمان آب دهی با رقیق کردن محیط، مانع از تورم بیش از حد سلول می‌شوند.

غلظت زیاد ضد یخ نفوذ ناپذیر در خارج سلول باعث تنظیم و تعادل دو طرفه سلول می‌شود.

به عبارتی، این امر باعث کاهش تفاوت اسمزی داخل و خارج سلول به خصوص پس از انجماد می‌شود.

به عنوان مثال، اگر سلولی که حاوی ضد یخ می‌باشد درون محیط غلیظ ساکارز حدود 1 مول (ضد یخ نفوذ ناپذیر) قرار بگیرد، سلول ممکن است به علت خروج هم زمان ضد یخ و آب از سلول چروک بخورد، بنابراین غلظت بالای ساکارز باعث خروج ضد یخ خواهد شد.

نقش ضد یخ در انجماد عملکرد ضد یخ‌ها متفاوت و پیچیده است.

با توجه به ویژگیهای متفاوت ضد یخ‌ها، نخوه محافظت آنها از سلول تفاوت دارد.

در مجموع، می‌توان به موارد زیر را اشاره کرد : افزودن ضد یخ به محلول انجماد باعث کاهش جزیی نقطه انجماد محلول می‌شود.

به عنوان مثال، در غلظت‌هایی از ضد یخ که در روش انجماد آهسته به کار برده می‌شود (5/1 مول) نقطه انجماد cْ3-2 کاهش می‌یابد.

ضد یخ با اتصال به ملکول‌های آب، باعث کاهش اثر توکسیک دیگر ترکیبات محلول می‌شود این حالت را تحت عنوان ویژگی انعقادی یا Colligative properties می‌شناسد.

بیشتر ضدیخ‌های نفوذ پذیر در آب به شدت حل می‌شوند و پس از محلول شدن به شکل محسوسی باعث افزایش درجه حرارت محلول می‌شوند.

این امر نشان می‌دهد، این ترکیبات ساختمان آب را تغییر داده و پیوندهای هیدروژنی ملکول آب را می‌شکنند.

علاوه بر این، ضد یخ‌های محلول قادرند خود، با ملکولهای آب پیوند هیدروژنی برقرار کنند.

به عنوان مثال گلیسرول، 1 و 2 پروپاندیول در صورت حل شدن در آب می‌توانند با آن پیوند هیدروژنی ایجاد کنند.

هیدروژن گروه OH ضد یخ با اکسیژن آب متصل می‌شوند و یا مولکول اکسیژن DMSO به پروتون آب می‌چسبد این اعمال با آزاد شدن حرارت همراه است.

همچنین در مرحله انجماد آهسته، در زمانی که تخمک آب زیادی از دست داده است و توسط یک محلول غلیظ نمکی محاصره شده، ضد یخ از طریق افزایش سطح نمک،‌ باعث محافظت تخمک می‌شود، این ویژگی را با عنوان Sall buffering می‌شناسند.

یکی دیگر از مواردی که ضد یخ باعث محافظت تخمک در مرحله انجماد می‌شود، زمانی است که در آب گیری از غلظت زیاد ضد یخ استفاده می‌شود، چنین مواردی در انجماد شیشه‌ای رخ می‌دهد.

به علت غلظت بالای محیط، کریستال یخ شکل نمی‌گیرد و محیط به یکباره به حالت شیشه‌ای تبدیل می‌شود (Vitrification).

در مرحله انجماد آهسته، ضد یخ با غلظتی در حدود 5/1 مول از طریق اسمز وارد سلول می‌شود.

در مدت زمانی که ضد یخ از طریق غشای سلول وارد می‌شود آب بسرعت خارج می‌گردد و این روند باعث بروز اشکالاتی در تخمک می‌شود.

از جمله ، به علت خروج زیاد آب ازسلول، تخمک چروک خورده، از حجم آن کاسته می‌شود، ولی به جهت نفوذ ضد یخ به سلول پس از مدتی تعادل بین دو سوی غشاء برقرار شده و سلول به اندازه طبیعی خود بازگشت می‌کند (به اندازه اول یا نزدیک به آن می‌رسد) مشکل جدی پس از انجماد، در زمان خروج ضد یخ از سلول و شستشوی آن به وجود می آید.

در این زمان، سلول در محیطی واقع شده است که غلظت ضد یخ بیرون سلول کمتر از داخل آن می‌باشد و آب به درون سلول وارد می‌شود، در هر حال، سرعت ورود آب به سلول بیشتر از سرعت خروج ضد یخ از سلول است و این دو باعث تورم سلول و یا ترکیدن آن می‌شود.

برای جلوگیری از انهدام سلول می‌توان خروج ضد یخ را در چند مرحله (بین سه تا 10 مرحله) انجام داد و از غلظت‌های زیاد به غلظت‌های کم ضد یخ استفاده کرد.

به عنوان مثال، از غلظت‌های 5/1، 1، 5/0، 25/0 مول ضد یخ به ترتیب استفاده کرد.

این عمل مانع از تورم سلول نمی‌شود، بلکه باعث کاهش شدت تورم خواهد شد.

در هر مرحله مدت زمانی در حدود 3-10 دقیقه صرف خواهد شد تا سلول و محیط اطراف به تعادل برسند.

زمان تعادل qulibration time برای جلوگیری از تشکیل کریستال یخ داخل سلولی لازم است که آب درون سلول تخلیه شود.

این عمل با قرار دادن تخمک در یک محیط هیپرتونیک حاوی ضد یخ انجام می‌شود.

ضد یخ‌های نفوذ پذیر به راحتی وارد سلول می‌شوند و آب درون سلول نیز متقابلا به علت فشار اسمزی زیاد خارج می‌شود و به بیرون جریان می‌یابد.

به هر حال سرعت خروج آب از سلول بیشتر از سرعت ورود ضد یخ به سلول است.

پس از مدتی، تعادل بین ورود ضد یخ و خروج آب از سلول برقرار می‌شود.

مدت زمانی که طول می‌کشد تا تعادل بین دو سوی غشاء تخمک برقرار شود، «زمان تعادل» نامیده می‌شود.

دو نکته اساسی را باید در آبگیری تخمک در نظر گرفت.

چون اکثر ضد یخ‌ها توکسیک هستند و برای تداوم حیات تخمک مضر هستند حتی الامکان، باید مدت زمان تعادل را کم کرد تا از وارد آمدن صدمه به تخمک جلوگیری شود.

از طرفی، اگر مدت زمان آبگیری به حدی کم باشد که آب داخل سلول خارج نشود، آب باقی مانده درون سلول تبدیل به کریستال یخ می‌شود و منجر به تخریب سلول و یا ارگانل‌های آن می‌شود.

به این ترتیب، مشخص است که انتخاب زمان مناسب، جهت تعادل ضد یخ و تخمک دریک انجماد اهمیت زیادی دارد.

چون نفوذ پذیری تخمک به انواع ضد یخ متفاوت است از این نظر زمان تعادل بستگی زیادی به نوع ضد یخ دارد.

به عبارتی، هر چه قدرت نفوذ پذیری ضد یخ بیشتر باشد زمان تعادل کوتاهتر است و برعکس.

علاوه بر این، یکی دیگر از فاکتورهایی که بر مدت زمان تعادل تأثیر دارد، مرحله تکاملی تخمک می‌باشد، معمولاً تخمک قبل از لقاح، نفوذ پذیری کمتری در مقایسه با بعد از لقاح دارد.

بنابراین مدت زمان تعادل برای تخمک لقاح نیافته بیشتر از تخمک لقاح یافته است.

تشکیل یخ داخل سلولی Intracellular Ice Formation یکی از اهداف اصلی مطالعات کرایوبیولوژی تخمک، کنترل کمیت و موقعیت مکانی کریستال‌های یخ در مراحل انجماد است.

آنچه مسلم است، آبگیری شدید سلول در مرحله انجماد آهسته، صدماتی را به تخمک وارد می‌کند و تشکیل کریستال یخ داخل سلولی نیز بی شک برای آن کشنده است.

شدت آسیب وارد شده به سلول بستگی به حجم کل کریستال‌های یخ و بزرگی یک کریستال به تنهایی دارد.

مکانیسم تشکیل هسته مرکزی یخ داخل سلول تا به حال شناخته نشده است.

بعضی از افراد معتقدند که کریستال‌های یخ خارج سلولی، از راه سوراخ‌های موجود در غشاء وارد سلول شده و باعث تشکیل کریستال یخ در داخل سلول می‌شوند.

عده‌ای دیگر معتقدند که هنگام عمل سرد شدن و انجماد تخمک، ارتباطات بین ملکول‌های غشاء سلول بهم خورده و ترکیبات هتروژنوسی که در سطح داخل غشاء قرار دارند، در حین آبگیری و در اثر چروک خوردن سلول از آن جدا می‌شوند و به درون سیتوپلاسم رها می‌گردند.

و بعد به عنوان هسته مرکزی تشکیل کریستال یخ عمل می‌کنند.

اندازه کریستال‌ها بستگی به سرعت انجماد دارد، اگر سرعت انجماد آهسته باشد کریستال‌های بزرگ شکل می‌گیرند و اگر سرعت انجماد زیاد باشد کریستال‌های یخ کوچک به وجود می‌آیند.

به همین روش اگر سرعت ذوب آهسته باشد، کریستال‌های یخ کوچک به علت انرژی سطحی بیشتری که نسبت به کریستال‌های بزرگ دارند به یکدیگرمتصل شده و کریستال‌های یخ بزرگتری را بوجود می‌آورند، به عبارتی کریستال‌ها رشد می‌کنند.

این کریستال‌های بزرگ صدمات زیادی را به سلول وارد می‌کنند و برعکس اگر سرعت ذوب زیاد باشد ، فرصت لازم برای تشکیل مجدد کریستال یخ (re crystallization) و یا بزرگ شدن کریستال‌های یخ در اختیار سلول قرار نمی‌گیرد، و در نتیجه، کریستال یخ شکل نخواهد گرفت.

القای یخ زدگی Seeding برای انجماد سلول‌هایی با ابعاد کوچک نیاز به القای تشکیل یخ خارج سلولی نیست اما، در مورد سلول‌های بزرگ مثل تخمک، القای تشکیل بلور یخ خارج سلولی اهمیت دارد.

زیرا، مانع از فراسرما (super cooding) شده و باعث تسهیل آبگیری سلول می‌شود.

آب معمولی در دمایی کمتر از نقطه انجماد آب خالص یخ می‌زند.

نقطه انجماد آب خالص در فشار یک اتمسفر صفر درجه است در حالی که، آب معمولاً در دمایی حدود cْ2- یخ می‌زند.

در صورتی که از ضد یخ با غلظتی در حدود 5/1 مول استفاده شود، دربرودت cْ3- تا cْ5- درجه یخ می‌زند.

این امر، به دلیل آرایش خاص ملکولهای آب است که در برابر یخ زدن مقاومت می‌کنند و در صورتی که عاملی این نظم ملکولی را بهم بزند بلورهای یخ شروع به تشکیل شدن خواهند کرد.

اگر بلورهای یخ به موقع در محیط بیرونی تخمک تشکیل نشود، محلولی که تخمک در آن قرار گرفته تا چند درجه زیر صفر یخ نخواهد زد.

چنین محلولهایی ممکن است حتی تا cْ15 پایین تر از دمای انجماد محلول به حالت یخ نزده باقی بمانند.

یخ زدن تدریجی برای انجماد تخمک حیاتی است، زیرا یخ زدن با آزاد کردن گرمای پنهان ملکول‌های یخ همراه است.

از طرفی یخ زدن آب بیرون سلول باعث افزایش فشار اسمزی شده و به خروج آب از تخمک کمک می‌کند.

زمانی که یخ زدگی در زمان خودش آغاز شود تشکیل و پیشرفت بلورهای یخ به صورت تدریجی روی می‌دهد و در نتیجه هم حرارت آزاد شده خیلی کم است و هم افزایش فشار اسمزی تدریجی است.

ولی وقتی که محلول در دمای cْ15- و پایین تر یخ بزند تمام محلول به طور ناگهانی یخ خواهد زد و چنین پدیده‌ای از طرفی باعث افزایش ناگهانی حرارت محیط خواهد شد و از سویی به دلیل خارج شدن آب در زمان مناسب از تخمک، ممکن است آب باقیمانده یخ بزند.

درهر حال، در هر دو حالت باعث وارد آوردن صدمه به تخمک می‌شود.

زمانی که محلول در دمای cْ5- تا cْ7- وادار به یخ زدن می‌کند بلورهای یخ به داخل سلول انتشار نمی‌یابند، که علت آن یکی وجود غشای سلول و دیگر وجود محلول با اسمولاریته بالا در داخل و خارج تخمک است.

به دنبال القاء، یخ زدگی غلظت مواد محلول در بخش یخ زده افزایش می‌یابد.

این افزایش غلظت در ناحیه مجاور سلول باعث اعمال فشار اسمزی به تخمک می‌شود که متعاقب آن آب از درون به بیرون تخمک انتشار می‌یابد و در بیرون سلول یخ می‌زند.

اگر سرعت انجماد به اندازه کافی کم باشد، آب درون سلول به تدریج به بیرون نفوذ می‌کند وزمانی که تخمک داخل نیتروژن مایع قرار می‌گیرد تقریباً آب قابل یخ زدن در تخمک وجود ندارد.

اگر چه آبگیری پیش از انجماد سلول، از تشکیل کریستال یخ داخل سلول جلوگیری می‌کند اما در هنگام ذوب به خصوص اگر از سرعت‌های بالا استفاده شود باعث آسیب رساندن به تخمک می‌شود.

در اغلب روش‌های انجمادی آهسته، جهت القاء یخ زدگی محلولی را که تخمک در آن قرار گرفته، به طور دستی در دمای حدود cْ5- تا cْ7- وادار به یخ زدن می‌کنند.

به این منظور، بخشی از محلول را به شدت سرد می‌کنند به طوری که آب در آن نقطه یخ زده و سپس به کندی به سایر نقاط سرایت می‌کند.

متداولترین روش، استفاده از گیره‌ فلزی است که از پیش در دمای cْ196- سرد شده است.

با نزدیک کردن چنین گیره‌ای به نی انجماد حاوی تخمک، یخ زدن در آن القاء می‌شود.

ذوب Thawing در مرحله ذوب، وقوع دو حادثه ممکن است باعث تخریب و انهدام سلول شود : تشکیل مجدد کریستال یخ recryslalization داخل سلول شوک اسمزی تشکیل مجدد کریستال یخ، بستگی به سرعت انجماد و ذوب دارد.

در زمانی که سرعت انجماد سریع است چون آبگیری به طور کامل صورت نمی‌گیرد.

مقداری آب، درون سلول باقی می‌ماند.

اگر ذوب نیز به آرامی انجام شود این فرصت‌ به سلول داده می‌شود که آب باقیمانده در هنگام عبور سلول از نقطه انجماد به کریستال یخ تبدیل می‌شود.

اگر سرعت ذوب زیاد باشد از شکل گیری کریستال یخ جلوگیری خواهد کرد.

مشکل دیگر شوک اسمزی است که در اثر انجماد آهسته و ذوب سریع به وجود می‌آید.

به علت ذوب یخ خارج سلولی، محیط خارج سلول رقیق شده و چون ضد یخ وارد شده به سلول به سرعت نمی‌تواند از سلول خارج شود و آب سریع تر از آن وارد می‌شود، سلول دچار تورم می‌شود در هر حال، به علت توکسیک بودن ضد یخ باید بدون فاصله پس از ذوب، ضد یخ را از محیط اطراف و درون تخمک خارج کرد.

اگر نمونه به طور مستقیم وارد یک محلول ایزوتونیک شود مثل بافر فسفات سالین، سلول متورم شده و منهدم می‌شود.

به این منظور از محلول‌های حاوی ضد یخ استفاده می‌شود.

دو روش کلی برای خروج ضد یخ و شستشوی تخمک وجود دارد : رقیق کردن چند مرحله‌ای محیط استفاده از محلول حاوی ضد یخ نفوذ ناپذیر.

رقیق کردن چند مرحله‌ای محیط این روش به وسیله Whittingham و Willmut و همکاران آنها در 1973 مطرح شد.

آنان با استفاده از محلول‌های حاوی ضد یخ، که به تدریج از غلظت ضد یخ آن کاسته شده بود، استفاده کردند تا ضد یخ از سلول خارج شود.

ذوب با کمک ضد یخ‌های نفوذ ناپذیر Schneider , Leibo پیشنهاد کردند با استفاده از محلول حاوی ضد یخ نفوذناپذیر مانند ساکارز می‌توان ضد یخ نفوذ پذیر را از سلول خارج کرد.

غلظت ضد یخ نفوذ ناپذیر باید نصف غلظت ضد یخ نفوذ پذیر به کار گرفته شده در حین انجماد باشد.

گاهی اوقات بدون عمل رقیق کردن هم می‌توان سلول را ذوب کرد.

به خصوص در مواردی که ضدیخ اثر توکسیک کمی دارد.

به عنوان مثال، Rall و همکاران او در 1984 با استفاده از متانل جنین را منجمد کردند و چون متانل برای جنین توکسیک نبود و بسرعت از سلول خارج می شد نیاز به شستشو و رقیق کردن محیط هم نبود.

روش انجماد آهسته تخمک و جنین به طور اجمال، در این روش از ضد یخ های 1 و 2 پروپاندیول (PROH) (Merk) به همراه ساکارز استفاده می شود.

ابتدا تخمک‌ها و یا جنین در برابر محلول حاوی ضد یخ به تعادل رسیده (آبگیری شده) و پس از انتقال به نی فریز Stromberg Germany CTE 880-0-2-EC درون دستگاه فریزر اتوماتیک Cryo-Technic ، CTE 880 ، ‌Stromberg Germany ، Erlangen به آرامی سرد و سپس منجمد می شوند.

پس از انجماد به سرعت ذوب شده و با محلول های مختلف حاوی ضد یخ و ساکارز شستشو و آبدهی می شوند.

محلول های مورد نیاز پس از تهیه بافر PBS ، به آن 20% سرم آلبومین انسانی و یا به ازای هر میلی لیتر 5-4 میلی گرم BSA اضافه می شود و بعد محلول های زیر با استفاده از بافر یاد شده تهیه می شود: