تحقیق ضرورت انجماد تخمک و جنین

با توجه به پیشرفت‌های شگرفی که در علم کرایوبیولوژی صورت گرفته بشر توانسته از روش‌های متنوع آن در نگهداری سلول‌های جنسی و جنین بهره ببرد. اکنون با انجماد جنین، کمک شایانی به افراد نابارور شده است. ولی موفقیت در انجماد تخمک با توجه به شرایط خاص سلول و حساسیت بیش از حد آن نسبت به شوک‌های حرارتی و برودتی بسیار پایین بوده است. تا به حال گزارشات کمی در ارتباط با انجماد موفق تخمک انسان به دست آمده است. اما ضرورت انجماد تخمک به دلایلی مانند سندرم تحریک بیش از حد تخمدانی (هیپراستیمولاسیون تخمدان)، ابتلاء فرد به سرطان به خصوص در سنین جوانی، نبود موفقیت مرحله اول انتقال جنین در رحم، و تقاضای والدین برای فرزند دیگر در سال‌های آتی و حتی حفظ گونه‌های کمیاب جانوری برکسی پوشیده نیست و کم و بیش نیاز آن احساس می‌شود.

سه روش عمده در انجماد تخمک مطرح است: روش آهسته، شیشه‌ای و فوق سریع. در هر سه روش محققان  تلاش می‌کنند با کاهش میزان  تشکیل کریستال یخ داخل و خارج سلولی در انجماد و ذوب، قدرت حیاتی تخمک را افزایش دهند. دو فاکتور اساسی در این امر دخالت دارد یکی استفاده از ضد یخ که باعث خروج سریع آب داخل سلولی می‌شود و دیگری سرعت انجماد که برای هر سلول متفاوت است و بستگی به نفوذ پذیری غشاء، نسبت سطح به حجم سلول و درجه حرارت دارد. تحقیقات نشان می‌دهد که به علت نبود اطلاعات کافی در ارتباط با تأثیر انواع ضد یخ بر تخمک و صدمات وارد شده به آن، میزان موفقیت پایین است.

در روش انجماد آهسته، ضد یخ‌های نفوذپذیر با غلظت در حدود 5/1 مول به کار گرفته می‌شوند. بنابراین، لازم است سرعت انجماد به گونه‌ای تنظیم شود که فرصت لازم برای خروج آب از سلول در اختیار آن قرار گیرد. این روش،‌برای اولین بار به وسیله Whithingham و همکارانش در 1972 مطرح شد. آنان، جنین دو سلولی موش را با موفقیت منجمد کرده و سالم بازیافت کردند. تاکنون، پیشرفت‌های چشمگیری در انجماد جنین حاصل شده است و به شکل مستمر از آن استفاده می‌شود، بر خلاف تلاش‌های زیادی که جهت بهبود انجماد تخمک در گونه‌های مختلف جانوری به روش آهسته صورت گرفته است این روش نتوانسته کمک شایانی به افراد تحت درمان نازایی داشته باشد.

هم اکنون جهت ساده کردن روش انجماد از انجماد شیشه‌ای استفاده می‌کنند و نتایج بدست آمده از این روش مشخص کرده که روش مناسب تری در مقایسه با روش آهسته است. در روش اخیر، به علت استفاده از غلظت بالای ضد یخ حدود (40%) و کوتاهی زمان آب گیری (زمان تعادل) آب بسرعت از سلول خارج شده و در حین انجماد، محیط اطراف سلول به یکباره تبدیل به شیشه می‌شود.

اولین بار این روش در 1937 به وسیله Luyet مطرح شد و اکنون در نگهداری جنین و تخمک گونه‌های مختلف جانوری به کار گرفته می‌شود. در انجماد شیشه‌ای دو نکته حائز اهمیت، انتخاب ضد یخ و غلظت مناسب آن است. انتخاب این دو فاکتور باید به گونه‌ای باشد که اولاً کریستال یخ داخل و خارج سلول شکل نگیرد ثانیاً غلظت به کار گرفته شده برای سلول کشنده نباشد. محلول‌های انجماد شیشه‌ای معمولاً حاوی ضد یخ‌های نفوذ پذیر (مثل گلیسرول، اتیلن گلیکول، 1 و 2 پروپاندیول)، دی ساکارید‌های کوچک (مثل ساکارز، تری هالز، گلوکز) و ماکرومولکول‌ها (مثل پروپیلن گلیکول، فیکول 70، آلبومین سرم گاوی) می‌باشند.

نتایج محققان نشان می‌دهد، به کارگیری روش‌های یاد شده به همراه ضد یخ‌های نفوذ پذیر و نفوذ ناپذیر اثرات متفاوتی را بر تخمک گذاشته و حتی اعمال یک روش واحد برای انجماد تخمک یک گونه نیز نتایج متناقضی دارد.

به کارگیری ضدیخ‌های مختلف به تنهایی و یا در فرایند انجماد، می‌تواند اثرات زیادی را بر فراساختمان‌ سلول داشته باشد. از حساس ترین ساختار، نسبت به تغییرات شدید برودتی، حرارتی و یا غلظت‌های مختلف ضد یخ می‌توان اسکلت سلول، میتوکندری و قشر شفاف را نام برد. از آنجا که بسیاری از فعالیتهای مهم سلول از جمله، جابجایی کروموزومها طی تقسیم و سیتوکنزیس وابسته به عناصر اسکلت سلول می‌باشند هر گونه بهم خوردگی در این بخش‌ها تاثیر زیادی را بر تکوین تخمک و جنین‌های به دست آمده دارند. از شایعترین این حوادث وقوع ناهنجاری کروموزومی در جنین‌های به دست آمده از تخمک‌های منجمد شده می‌باشد حتی سختی قشر شفاف که در اثر تغییر ماهیت بیوشیمیایی آن بوقوع می‌پیوندد بطور مستقیم در نفوذ اسپرم به تخمک و لقاح آن تاثیر منفی می‌گذارد و باعث کاهش قدرت لقاح آن می‌شود.

انجماد آهسته تخمک و جنین

روش انجماد آهسته، برای اولین بار به وسیله Whithingham و همکارانش در 1972 مطرح شد. او از روش جهت انجماد جنین دو سلولی موش استفاده کرد و توانست با موفقیت زیاد جنین‌های دو سلولی را پس از ذوب سالم به دست آورد. او در این تجربه از روش انجماد و ذوب آهسته استفاده کرد. از آن پس پیشرفت‌های چشمگیری در انجماد جنین به دست آمد، تا جایی که این روش به شکل روزمره درآمد. هم زمان با انجماد جنین، تلاش‌های زیادی در جهت انجماد آزمایشگاههای مختلف جانوری به روش آهسته صورت گرفت که نتایج آن کاملاً ضد و نقیض IVF تخمک گونه‌های است.

محققان با بررسی فاکتورهای مختلف، سعی کردند روش انجماد آهسته تخمک را بهبود بخشند. از مهمترین فاکتورهای مورد بررسی می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

شناخت ساختار تاثیر سرعت انجماد به روش آهسته (سرعتی کمتر از تخمک c/minْ1) و به روش سریع.

تاثیر القای یخ زدگی در برودت نزدیک cْ7- در موفقیت انجماد تخمک

نقش انواع ضد یخ در انجماد تخمک

بررس روش‌های مختلف ذوب و خروج ضد یخ از تخمک

بررسی خصوصیات فیزیک و شیمیایی غشای تخمک در مراحل انجماد

اساس انجماد آهسته  

مراحل انجماد آهسته تخمک عبارتست از:

آب گیری تخمک با استفاده از ترکیب حاوی ضد یخ و به تعادل رساندن آنها.

سرد کردن تخمک تا برودت زیر صفر درجه سانتی گراد

القای یخ زدگی یا seeding در برودت نزدیک cْ7- و تشکیل کریستال یخ خارج سلولی.

نگهداری در ازت مایع (cْ196-)

ذوب تخمک و رقیق کردن محیط به منظور خارج ساختن ضد یخ از سلول

در مراحل انجماد و ذوب ساختمان سلولی، تخمک باید حفظ شود و صدمات وارد شده به سلول در اثر تشکیل کریستال‌های یخ داخلی سلولی، به حداقل برسد. بنابراین، پیش از انجماد و یا در مرحله سرد شدن تخمک باید آب داخل سلولی را خارج کرد و میزان آن را به حداقل رسانید. اگر این عمل به روش مناسب و کافی صورت نگیرد، کریستال‌های یخ درون سلولی شکل شده و باعث نابودی تخمک می‌شوند. آب درون سلولی را می‌توان به چند روش خارج کرد.

با استفاده از محلول غلیظ ضد یخ.

با القای یخ زدگی که باعث تشکیل کریستال‌های یخ خارج سلولی می‌شود. در این حالت به علت کم شدن مقدار زیادی از آب خارج سلول دراثر تشکیل کریستال یخ، محیط اطراف تخمک غلیظ تر شده و غلظت نمک‌ها و املاح افزایش می‌یابد که خود کمک موثری در خروج آب از سلول می‌کند.

یادآوری می‌شود، روش‌های ذوب متفاوتی به کار گرفته می‌شود از جمله، روش آهسته و روش سریع. نتایج محققان نشان می دهد که انتخاب روش ذوب سریع درصد زنده ماندن تخمک ها را پس از ذوب افزایش می‌دهد. زیرا در عمل ذوب اگر سرعت ذوب آهسته باشد، زمان کافی در اختیار کریستال‌های یخ قرار می‌گیرد و کریستال‌های بزرگ یخ به وجود می‌آید که این امر سبب صدمات زیادی به تخمک‌ می‌شود.

در مجموع از مهم ترین فاکتورهایی که در سلامت تخمک پس از انجماد تاثیر دارند می‌توان، گونه و نژاد جانور، مرحله تکامل تخمک، ضد یخ بکار گرفته شده، روش انجماد، سرعت انجماد، روش ذوب و سرعت ذوب را نام برد.

حفظ سلول در برودت زیر صفر درجه سانتی گراد

در انجماد و ذوب سلول دو مرحله حساس وجود دارد که می‌تواند مخرب نیز باشد. یکی در شروع انجماد و در مراحل سرد کردن سلول و دیگری در زمان ذوب آن است. اگر سلول‌ها در برودت خیلی زیاد نگهداری شوند قدرت حیاتی خود را می‌توانند تا مدت طولانی حفظ کنند. برودت آب به شکل کریستال یا شبیه به شیشه درمی‌آید و هیچ واکنشی وابسته به حرارت در این سیستم آبی انجام پذیر نیست. اما، اگر سلول در cْ80- نگهداری شود به مرور زمان قدرت حیاتی خود را از دست می‌دهد. تنها نکته قابل توجه در انجماد گامت و یا جنین در cْ196- این است که اسیدهای دی اکسی ریبونوکلئیک یا DNA سلول ممکن است تحت تشعشعات ازت مایع دچار شکست شوند.

هنگامی که سلول در برودت cْ5- تا cْ15- قرار می‌گیرد ابتدا کریستال‌های یخ خارج سلولی شکل می‌گیرند و اگر غشاء، مانع از ورود کریستال‌های یخ خارج سلول به داخل سلول نشود، کریستال یخ به وجود نخواهد آمد. زمانی که غشای سلول نسبت به آب نفوذپذیر باشد ولی نسبت به یخ غیر قابل نفوذ باشد آب از سلول خارج می‌شود. زیرا که پتانسیل شیمیایی داخل سلول از پتانسیل شیمیایی خارج سلول بیشتر است. خروج آب از سلول باعث تغلیظ محتویات سلول می‌شود و به مرور پتانسیل شیمیایی آن را کاهش می‌دهد و آب خارج شده از سلول نیز منجمد می‌شود.

زمانی که سلول به آرامی سرد و سپس منجمد شود، پدیده خروج آب از سلول باعث کاهش تفاوت پتانسیل شیمیایی دو سوی غشاء می‌شود و اگر سلول بسرعت سرد شود به علت نبود زمان کافی برای خروج آب از سلول و برقراری تعادل بین دو سوی غشاء محتویات داخل سلول دچار فراسرما (supercooling) می‌شوند و کریستال‌های یخ تشکیل شده در سلول باعث بر هم خوردن تعادل شیمیایی در درجه حرارت بالای cْ15- می‌شوند.

زمانی که یک محلول منجمد می‌شود، غلظت مایع باقی مانده افزایش می‌یابد. به عنوان مثال، زمانی که محلولی تا cْ10– سرد شود غلظت الکترولیت‌های محلول 20 برابر افزایش می‌یابد. لازم به یادآوری است. رابطه مستقیمی بین غلظت نمک و مرگ سلولی در طی انجماد وجود دارد، lovelock مشخص کرد اگر غلظت الکترولیت داخل و خارج سلول افزایش یابد غشای سلول بر هم خورده و باعث مرگ سلول می‌شود. مشکل یاد شده که در اثر تغییرات غلظت محیط صدمات زیادی بر سلول وارد می‌آورد را با عنوان solution effects یا تاثیرات محیط می‌شناسند.