گزارش انجام آزمایشات میکروبیولوژی محیطی

عنوان آزمایش : 1- جمع آوری و نگهداری نمونه های خاک

2 - تهیه لام های دفن شده در خاک

آشنایی با روش نمونه برداری، نگهداری و تهیه لام از خاک

میکرو بیولوژی و شیمی خاک حایز اهمیت می باشند که بر اساس اصول صحیح جمع آوری و نگهداری کرده و آزمایش مورد نظر را انجام می دهیم نکته مهم اینکه خاک از جمله محیطهایی است که حتی در یک محدوده معین ویژگیها و شرایط آن از نظر فیزیکی- بیولوژیک و شیمیایی با همدیگر فرق دارند. مثلاً در یک محدوده خاص مثل بلندی تپه در مقایسه با ارتفاع کم ویژگیهای متفاوت می باشد و حتی در یک باغچه که به آن کود داده می شود جاهایی که کود بیشتری دریافت کرده و یا کمتری دریافت کرده شرایط متفاوتی دارد، بنابراین تهیه این نمونه ها یا به منظور انجام آزمایشهایی میکرولوژی انجام می شود و یا آزمایشهای شیمیایی که این دو تفاوتی کوچک از نظر جمع اوری و نگهداری دارند. برای نمونه برداری و جمع آوری از دستگاههای نمونه بردار خاصی آگلر استفاده می شود که غالباً نوعی لوله نمونه برداری است که طول و قطر مشخص دارد و جنس آن عموماً فلزی می باشد و ویژگی که دارند روی سطح آنها مدرج شده است که به منظور اندازه گیری از عمق مورد استفاده قرار می گیرد که به شکل عمودی بر روی نقطه ای که برای برداشت نمونه مشخص شده است قرار گرفته است و با فشار دادن دست یا فشارمکانیکی در خالک فرورفته تا عمق مورد نظر ازخاک پر می شوند و بعد محتویات آنها با یک ظرف ترجیحاً استریل یا یک کیسه پلاستیکی منتقل می شوند.

مرحله دوم نگهداری نمونه ها می باشد که اگر مجبور به نگهداری شویم بایستی نمونه های جمع آوری شده در شرایطی که از نظر دما و رطوبت تشابه زیادی با زمان برداشت نمونه دارند نگهداری شوند که مثلاً در مورد نمونه های میکروبی دمای مشابه دمای برداشت نمونه  مناسب بوده که فعالیت میکرو ارگانسیم ها را کند می کند در مورد آزمایشهای شیمیایی روشهایی مانند منجمد کردن و خشک کردن برای نگهداری مورد نظر می باشد .

مرحله انجام آزمایش:

برای شروع کار ابتدا یک نقطه مناسب را برای برداشت نمونه در نظر می گیریم و در مرحله اول باید یک برچسب تهیه کرده و مشخصات دقیق محل برداشت نمونه را روی آن برچسب می نویسیم یعنی اینکه اگر برای برداشت مجدد نیاز باشد بایستی بتوانیم نمونه برداری را عیناً تکرار کنیم که بتدریج فناوریهای جدید مثل    GPS نیز مورد استفاده قرار می گیرد در درجه دوم مشخصات ظاهری خاک  را بایستی یادداشت کنیم که شامل: نوع دانه بندی خاک- پستی و یا بلندی - خشکی و دیگر مشخصات و بعد از مدتی که مراجعه کردیم متوجه تغییرات آن شویم معمولاً این برچسبها حاوی تاریخ، شرایط اقلیمی، نام نمونه بردار و هر اطلاعات دیگری که لازم بوده و به تفسیر نتایج آزمایش کمک کند می باشد.

انجام آزمایش:

پس از تحویل گرفتن وسایل مورد نیاز شامل یک کیسه نایلون تمیز و دماسنج و تیغه محل نمونه برداری پشت آزمایشگاه کنار درخت بزرگ زبان گنجشک و قسمت شمال غربی آن تعیین گردید و ضمن مراجعه در محل با استفاده از لوله مخصوص که برای نمونه برداری پیش بینی شده بود با فشار مکانیکی در محل مورد نظر اقدام به نمونه برداری و تخلیه آن داخلا یک پلاستیکی گردید البته قبلاً با استفاده از دما سنج مخصوص و با فرو کردن آن در داخل و ایست چند دقیقه ای درجه حرارت خاک  تعیین گردید سپس درجه حرارت هوا نیز اندازه گیری و  بود. پس از ثبت مشخصات شامل 1- نام نمونه بردار: علی اکبر نوروزی 2- ساعت 15/15 روز دوشنبه 3/12/84 3- مکان: آموزشکده محیط زیست پشت آزمایشگاه میکرولوژی جنب درخت بزرگ زبان گنجشک و قسمت شمالی آن 4- درجه حرارت هوا   5- درجه حرارت خاک   6- شرایط اقلیمی : هوا مرطوب و پس از حدود ده ساعت بارندگی متناوب

در مرحله بعد از تحویل گرفتن یک عدد بوکال ( وسیله قراردادن خاک و لام ها و تماس آنها با همدیگر به منظور ایجاد تماس مناسب محیط کشت با خاک) و 6 عدد لام یا اسلاید که با استفاده از میکروفیلم  آنها را به هم چسباند هو نفوذ ناپذیری آن را تضمین می کنیم که یک طرف آنها را با سواپ که قبلاً با استفاده از محیط کشت نوترینت براث (NB) آغشته می کنیم ( در شرایط استریل)

پس از آماده کردن سه عدد اسلاید دو طرفه که یک طرف آن آغشته به محیط کشت NB   می باشد آنها را با فاصله در داخل بوکال قرار می دهیم و سپس با استفاده از قاشقک میان آنها را با آرامی با خاک پر می نماییم و درب بوکال را بسته و در دمای  گرما گذاری می کنیم که اگر شرایط دمای اطاق این باشد مطلوب است در غیر اینصورت آن را داخل انکوباتور به مدت دو هفته قرار می دهیم تا میکروارگانیم ها روی آن رشد کند.

عنوان آزمایش: الف) شمارش باکتری های هتروتروف هوازی خاک به روش plate

 count

هدف: آشنایی با روش کلاسیک شمارش باکتری های زنده

تاریخ: 10/12/84

انجام آزمایش:

باکتریها غالبترین جمعیت میکروارگانیم های خاک را تشکیل می دهند و در خاکهای معمولی بین  عدد در هر گرم خاک موجود می باشند در خاکهای فاضلاب و لجن فعال یا کشاورزی یا کود دهی بالا با میکروبی بالایی دارند.

استفاده از رفتهای متوالی و کشت در پلیت به روش pour plate می باشد خاک بدلیل اینکه دارای باکتریهای زیادی می باشد قابل کشت بصورت مستقیم نمی باشد لذا ابتدا سوسپانیون را تهیه و با استفاده از  مایع مناسب که آسیبی به سلولها نرساند ماده جامد را وارد آن می کنیم و با استفاده از روشهای مکانیکی آن را به هم می زنیم یا با استفاده از دستگاهی بنام shaker  که با دور مشخص ( مثلاً 2000RPM یادویست دور در دقیقه ) به مدت ده دقیقه که سلولها به هم چسبیده جدا و معلق شوند البته این روش علاوه بر خاک  در مواد غذایی نیز مورد استفاده دارد . روش مناسب دقیق سازی تهیه وقتهای متوالی است که مایع مناسب برای آن سرم فیزیولوژیک یا آب مقطر می باشد.

دقت                         (خاک)   سرم فیزیولوژیک

که به ازای هر رقت یک پلیت خالی استریل در نظر می گیریم البته صحیح آن 3 دست برای هر لوله می باشد که به شرح ذیل می باشد که این عمل با استفاده از پییت مدرج استریل و یا رعایت شرایط سترون صورت می گیرد

پس از تلقیح نمونه ههای رقیق شده بر روی هر یک از پلیت های استریل بر روی هر پلیت  محیط کشت که قبلاً آماده کرده ایم  (  N.A) ریخته و آن را با حرکات 8 مانند زیگزاگی به هم می زنیم تا کاملاً مخلوط شوند پس آنها را با ثبت مشخصات گروه در دمای  به مدت 24 تا 48 ساعت در داخل انکوباتور گرما گذاری می‌کنیم.

ب) عنوان آزمایش: تعیین PH و در صد رطوبت خاک برای اندازه گیری PH  ابتدا 5 گرم از خاک را در داخل استوانه مدرج ( مزور) که  آب مقطر در داخل آن ریخته شده است و به داخل بشر می ریزیم البته آب مقطر بایستی به آرامی روی خاک ریخته شود و با استفاده از میله شیشه ای به هم می زنیم و می گذاریم تا کاملاً ته نشین شود و بعد با استفاده از PH متر آن را اندازه می گیریم البته الکترود آن بیایستی به ته تشر بچسبد.

PH=7027

برای اندازه گیری رطوبت خاک 100g خاک را داخل یک بشر مناسب که قبلاً وزن شده است اندازه می گیریم :

X= وزن خاک+ وزن بشر

پس نمونه را با بشر به مدت 24 ساعت در دمای  قرار می دهیم و پس ازخارج کردن آن را وزن می کنیم

درصد رطوبت خاک= 100  رطوبت خاک = وزن بشر با خاک - X

عنوان آزمایش: 1- مشاهده لام های دفن شده در خاک

2- شمارش و تعیین تعداد باکتریهای هتروتروف هوازی در خاک

باکتریها به صورت اتفاقی در محیط وجود ندارد و بصورت تحمعی هستند و در خاک هم ترجیح می دهند با استفاده از سطوحی که در خاک وجود دارد در صورت امکان اطراف جمع شده و توده ها و تجمعاتی ایجاد کنند. به هر حال خاک نسبت به محیط سنتزی امکاناتش محدودتر است و کلونیهای مشخص و بزرگی را که روی یک محیط کشت دیده می شود در خاک مشاهده نمی شود به همین جهت به آنها میکروکلونی گفته می شود یکی از روشهای مطالعه میکروبها در خاک استفاده از سطح مصنوعی در خاک و ایجاد میکرو کلونی می باشد که این عمل با استفاده از اسلاید‌های کلیشه ای روی یک طرف لام که ماده غذایی روی آن قرار داشته است را رنگی آمیزی کرده و میکروکلونی را می بینیم. خارج کردن اسوایه با یستی به آرامی صورت بگیرد و توصیه این است که روی یک تکه روز نامه با یک میله شیشه ای خاک اطراف اسلاید را کنار می زنیم و پس از آزاد سازی آن را بیرون می آوریم پس از آن یک لبه اسلاید که به پارافیلم چسبیده گرفته و روی روزنامه بازتر دیگر ضربه می زنیم به روی میز تا خاکهای به هم چسبیده جدا شوند پس پارافیلم را جدا کرده و سطح خارجی آغشته به سلولها و سطح داخلی کاملاً تمیز است سطح داخلی ( تمیز) : به منظور فیکس شدن سلولها سه بار روی شعله گرفته و فیکس می کنیم و رنگ آمیزی G انجام می دهیم و پس از آن زیر میکروسکوپ مشاهده می کنیم که در نهایت قارچ میسلیوم قرمز دیده می شود.

یاد آوری مراحل انجام رنگ امزی G : 1- کریستال ویوله 60 ثانیه 2- شستشو با آب مقطر 3- ایودین 60 ثانیه  4- شستشوی با آب مقطر  5- الکل واستن 6-5 ثانیه  6- سافرانین 45-30 ثانیه 7- شسشو با آب مقطر.

انواعی از تراکمها که قابل مشاهده می باشد: 1 - ریسه قارچها که میسلیوم قارچی بوده وچون اولین رنگ را جذب می کند آب مشاهده می شود و بدلیل اینکه  و  مختص باکتریها ست و قارچ پپتید و گلیکان ندارد که در شکل دیواره عرض میسلیوم به شکل منشعب می باشد و اگر به خوبی رشد کند اسپور آن به خوبی قابل مشاهده است

میکروکلونی باکتریها

گرم مثبت

گرم منفی

خوشه ای

کوکسی تک تک

میله ای

بدون اسپور که کاملاً آبی است

دارای اسپور داخلی

3- اکتینو میستها که باکتری های گرم مثبت و ظاهر رشته ای هستند و تقریباً  شبیه میسلیوم قارچها می باشند م مهمترین تفاوت آن این است که قطر رشته ای خیلی ظریف تر از قارچها می باشد و قارچها قطورتر و منشعب تر هستند.

4- ویروس ها که دیده نمی شوند   5- گاهی اوقات اگر خاک خیلی مرطوب باشد پروتوزوئرها دیده می شوند

ادامه کار هفته قبل:

پلیت ها را به ترتیب افزایش دقت 1-تا 6- به ترتیب کوچک شدن قرار می دهیم که بایستی تراکم کلونیهای رشد کرده کمی  با شد و شمارش را با شیوه ذیل شروع می کنیم البته بهترین روشهای شمارش نیز  خالی از خطا نمی باشد که عبارت است از : الف) کم بودن رقت ها ( خطای انساتی) ب) خود محیط کشت ممکن است برای همه باکتریها قابل استفاده نبوده باشد ج)  اگر خطا ها را به حداقل برسانیم می توانیم این کار را با دقت بیشتر انجام داده و به نتیجه بهتر برسیم

لخوه شمارش: از مجموع پلیت های کشت داده شده یکی را انتخاب می کنیم و از قطر تراکمی که بین 300-30 کلونی داشته باشد زیرا اگر کمتر از 30 تا باشد احتمال انتقال آلودگی محیط و بالعکس وجود دارد و قابل استناد نیست و اگر بیشتر از 300 مورد باشد ظرفیت ظرف بیش از آن نمی باشد. واحد شمارش آن C.  . F.U

(Colony forming   uhit)  و اساس آن بر این است که هر کلونی نماینده یک سلول می باشد که لازم آن جدا شدن سلولها از خاک با شرایط قابل قبول است اگر تعداد کلونیها را دقیق بشماریم مثل این است که تعداد سلولها را شمارش کرده ایم که در بعضی آزمایشگاهها از دستگاه کلونی شمار (   Colony  counter)   استفاده می شود . روی پلیت نور مناسب تابیده شده و با استفاده از یک قلم الکترونیکی کلونی شمارش می شود و قلم روی شیشه علامت گذاری کرده و احتمال شمارش مجدد از بین می‌رود.

در روش دستی پشت پلیت را با ماژیک وایت برد به چند قسمت تقسیم کرده و شمارش  را از  بالا پایین شروع می کنیم  البته یک خط را به صورت مشخص و قراردادی بایستی با خانه بالایی یا پایین محاسبه کرد و برای کاهش خطاها سه بار این کار  را انجام می دهیم و میانگین میگیریم پلیت انتخاب شده مربوط به    می باشد