تحقیق اندازه گیری میزان جهش زایی علف کش ها در آزمون لکه های بال مگس سرکه

خلاصه

در بخش حاضر علف کش های بنتازون (bentazone)، مولینات (molinate)، تیوبنکارب (thiobencarb) و تری فلورالین (trifluralin)، در مورد اثر جهش زایی و نوترکیبی زایی بررسی شده اند. این بررسی به وسیله‌ی آزمون لکه های بال در دروزوفیل (آزمون جهش و نوترکیبی سوماتیک SMART) انجام شده است. دو نوع آمیزش استاندارد (ST) و زیست فعالی زیاد (HB) استفاده شده است. آمیزش دوم با حساسیت زیاد به پیش جهش زاها و پیش سرطان زاها، شناخته می شود. لاروهای سه روزه، ترانس هتروزیگوت برای ژن های موهای چندتایی بال (mwh) و پهن شدگی-3 (flr3)، با شش غلظت متفاوت از هر نوع علف کش تغذیه شدند. تغذیه تا تبدیل شدن لاروهای باقیمانده، به شفیره ادامه یافت و تغییرات ژنتیکی القا شده در سلول‌های پیکری دیسک های فرضی بال منجر به شکل گیری کلون های جهش یافته روی تیغه‌ی بال شد. جهش های نقطه‌ای، شکست کروموزوم و نوترکیبی میتوزی، یک لکه ایجاد می کنند؛ در حالی که لکه های دوقلو فقط توسط نوترکیبی میتوزی تولید می‌شوند. بنتازون که به عنوان جهش زا شناخته نمی شد، به تست های لکه‌ی بال در آمیزش های HB، جواب مثبت داد. مولینات هم در آمیزش های استاندارد و هم در آمیزش های HB جواب مثبت داد. تیوبنکارب فقط برای آمیزش های استاندارد آن هم با بالاترین غلظت (10 میلی مولار) جواب مثبت داد. نهایتاً تری فلورالین، که در مورد جهش زایی مفصلاً مطالعه شده است، در مورد آزمون لکه‌ی بال برای هر دو نوع آمیزش، جواب مثبت داد.

1- مقدمه

مشخص شده است که بسیاری از مواد به خودی خود جهش زا نیستند، ولی بعد از وارد شدن به بعضی مسیرهای متابولیک، به مشتقاتی تبدیل می شوند که می توانند با DNA واکنش دهند. فعالسازی پیش جهش زاها در ابتدا توسط کمپلکس آنزیمی سیتوکروم P-450 انجام می شود. این کمپلکس آنزیمی قابلیت متابولیزه کردن مواد بسیاری را دارد. بیشتر خصوصیات مسیرهای متابولیسمی که به اندازه‌ی کافی مطالعه شده اند، شباهت اساسی در بین گونه های متفاوت دارد. با این همه، تبدیلات زیستی که پیش جهش زاها را به جهش زاها تبدیل می کنند می توانند در گونه های مختلف، متفاوت باشند.

تا کنون چندین استراتژی برای مطالعه‌ی اثرات جهش زا، معلول فعال شدن پیش جهش‌زاها در سیستم های زیستی متفاوت مثل میکروارگانیسم ها، گیاهان، دروزوفیل و سلول های پستانداران، استفاده شده است. بدون تردید شناخت مسیرهای متابولیسمی برای بررسی اثر جهش زایی علف کش ها لازم است زیرا بعضی از آنها برای فعال شدن باید در یک مسیر متابولیسمی تبدیل شوند.

آزمون جهش و نوترکیبی پیکری بال (SMART) در مگس سرکه، برای پیکری سریع و ارزان آسیب های ناشی از سم های جهش زا طراحی شد. اهمیت SMART در این است که اثرات را در زیوه و در حضور فرآیندها متابولیک بررسی می کند. به علاوه باید به یاد داشته باشیم که سیستم های فعالسازی متابولیک در مگس سرکه بسیار شبیه این سیستم ها در پستانداران است. در دوران جنینی سلول های دیسک‌های فرضی به طور میتوزی تقسیم می شوند و بسیاری از جهش های نقطه‌ای، حذف ها، نوترکیبی های میتوزی و جدا نشدن ها، در بال مگس سرکه قابل دیدن است. اگر در یکی از سلول های دیسک های فرضی جهشی ایجاد شود، این سلول یک کلون از سلول‌های جهش یافته ایجاد می کند که فنوتیپ یک مارکر مشخص را نشان می دهند. استفاده از سویه های با فعالسازی زیستی بالا (HB)، که خصوصیت آنها فعال تر بودن سیتوکروم P-450 است، پیدا کردن پیش جهش زاهای دسته های مختلف را تسهیل می‌کند.

در حال حاضر استفاده از علف کش ها از مجموع استفاده از حشره‌کش‌ها و قارچ‌ کش‌ها بیشتر دست دیدگاه عمومی این است که علف کش ها برای پستانداران تاثیر زیادی ندارند. ولی نتایج تحقیقات اخیر نشان می دهد که علف کش ها، تاثیراتی بر روی پستانداران هم دادند. در این نوشته نتایج آزمون SMART در مگس سرکه برای علف کش های نامبرده شده، آورده شده است. بنتازون یک نوع تیادیزین (thiadizine) است. مولینات و تیوبنکارب از تیوکاربامات ها (thiocarbamates) هستند و تری فلورالین یک نوع دی نیتروآنیلین (dinitroaniline) است. در سویه‌ی متفاوت، استاندارد و زیست فعالسازی زیاد، برای مشخص شدن نقش متابولیسم بر اثرات جهش زایی، استفاده شده اند.

از آنجا که علف کش ها پس از مصرف، جزء آلودگی های محیط زیست محسوب می‌شوند، این نوشته به آلودگی محیط زیست مربوط می شود.

2- روشها و ابزارها

سویه ها: برای آمیزش استاندارد، ماده‌هائی flr3/TM3, Bds با نرهای mwh آمیزش داده شده اند. برای آمیزش HB ماده های flr3/TM3, Bds NORR/NORR; با نرهای mwh NORR/NORR; آمیزش داده شدند.

دستورالعمل تجربی: تخم های ایجاد شده از هر آمیزش به مدت 8 ساعت در بطری‌های حاوی محیط کشت استاندارد ذرت و گوشت، تقویت شده با مخمر نانوایی، نگهداری شدند. بعد از 72 ساعت، لاروها با آب جدا شده و به ویال های پلاستیکی حاوی 5/4 گرم محیط کشت مگس سرکه منتقل شدند و 9 میلی لیتر از محلول‌های آزمایشی مربوط به آنها اضافه شد. ویال حاوی محیط کشت مگس سرکه با 5 درصد استون به عنوان کنترل منفی و با 1 میلی مولار EMS به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. لاروها تا رسیدن به مرحله‌ی شفیره روی این محیط کشت داد‌ه‌شدند. همه‌ی آزمایش‌ها در 25 درجه‌ی سانتی‌گراد و رطوبت نسبی 68% انجام شد. مگس های حاصل جدا شده و در محلول اتانول 70% نگهداری شدند.

هر دوی آمیزش های ST و HB دو نوع بال ایجاد می کردند که از راه مارکر Bds قابل تشخیص بودند: 1) مگس های هتروزیگوت برای مارکر، بال وحشی از لحاظ فنوتیپی، 2) مگس های هتروزیگوت برای بالانسر (balancer) با بال های دندانه- دندانه. بال ها جدا شده و توسط محلول Faure از آن ها اسلاید تهیه شد. هر دو روی بال با بزرگنمایی 400 برابر برای پیدا کردن لکه های جهش جستجو شد. نوع، اندازه و تعداد لکه ها ثبت شد.

این لکه های پیکری به سه دسته تقسیم شدند: (I لکه های کوچک و منفرد، (II لکه‌های بزرگ و منفرد، (III لکه های دوقلو. روی بال های مگس های هتروزیگوت برای وارونگی، فقط لکه هایmwh منفرد قابل تشخیص بودند زیرا کروموزوم بالانسر حاوی جهش وارونگی هیچ مارکرمناسب دیگری ندارد.

بررسی آماری: برای اندازه گیری اثر جهش زایی مشاهده شده، فراوانی لکه ها برای هر بال در هر گروه (که با ماده ای متفاوت و با غلظت متفاوت تیمار شده بودند) با فراوانی لکه ها برای کنترل منفی مربوط به همان گروه، مقایسه شد. برای محاسبات آماری، تست دو جمله ای شرطی با سطح اهمیت 5% استفاده شد.