تحقیق جدا سازی محصولات طبیعی آبزی

پیشگفتار :

اقیانوس ها در جهان بیش از 70% سطح زمین را می پوشانند و دارای بیش از 200000 بی بهره و گونه های جلبکی هستند . این ارگانیسم ها در جوامع پیچیده و در ارتباط نزدیک با دیگر ارگانیسم ها زندگی می کنند . چه به صورت ارگانیسم های ماکرو ( مانند جلبک ، اسفنج ، نرم  تنان پوشش دار و یا به صورت میکرو ( مانند باکتریهای غیررشته ای ، قارچ ها و آکتینوفایست ). بعضی از ارگانیسم ها مواد شیمیایی خود را از منابع غذایی به دست ‚ی آورند اگر چه مابقی آنها ترکیبات را دوباره سنتز می کنند . بعضی از ترکیبات ی توانند توسط میکرو ارگانیسم های مربوطه تولید شوند در حالی که مابقی آنها جهت تولید به یک ارتباط بین میزبان و میکرو ارگانیسم نیاز دارند . مواد شیمیایی یک نمونه خاص می توانند تحت تأثیر زیستگاه و عوامل فصلی و جغرافیایی باشد. در حقیقت منشاء واقعی بیوژنتیکی سنتز محصولات طبیعی آبزی در جامعه این محصولات یک موضوع مورد بحث است.

به علت تنوع ارگانیسم های آبزی و زیستگاهها ، تولیدات آبزی طبیعی طبقات شیمیایی زیادی را احاطه می کنند ( مانند ترین ها ) شیمیکیمات ها  ، پلی کتیو ها ، استوژنین ها ، پیتیدها، آلکالوئیدهای ساختارهای متفاوت و یک دامنه ای از ترکیبات بیوسنتز مخلوط ، در دهه گذشته به تنهایی ، ساختارهای بیش از 500 محصول طبیعی دریایی به چاپ رسیده اند.

در بسیاری از موارد طبقه ترکیب موجود در ارگانیسم می تواند بر اساس طبقه بندی ارگانیسم منبع پیش بینی شود . متأسفانه حتی  شناخت علم به طبقه ترکیب همیشه ما را در جهت تعیین یک ساز خالص سازی هدایت نمی کند . مجموعه هایی از محصولات طبیعی آبزی می توانند دارای چندین عامل شیمیایی باشند ( مانند oso3 – Na – Oac – och3 – oh ) . هرگونه تغییر در عامل می تواند تغییر اساسی در قطبیت ترکیبات ایجاد کند بنابراین روش مورد نیاز برای خاص سازی نیز تغییر خواهد یافت . به عنوان مثال نمونه های اسفنج ته دریایی با جنس Spomhosorites دارای آبیس ( ایندول ) آلکالوئید است. تاپستین ( طرح 1 ) ، ساده ترین ترکیب این مجموعه میتواند با کروماتوگرافی هر ژل سیلیکا با استفاده از مخلوطهای ckcl3  - Meoh به عنوان شوینده ، خالص گردد . در الگاسیدین  d ( طرح 2 ) ک دارای یک زنجیره جانبی . 2- آمینو ایمیدازول است که خیلی قطبی تر است وبه کروماتوگرافی بر فاز ثابت فاز معکوس و شسشه شدن با مخلوطهای اسید استونیتریل آب تری فلوئرواستیک ( TFA )  نیاز دارد . دراین حالت علم به طبقه ارگانیسم می تواند  در تعیین ساختار ترکیبات خالص کمک کند ولی در تعیین روش عالص سازی برای متابولیست قطبی تر که دارای یک عاملیت شمیایی غیر منتظره است کمکی نمی کند.

به منظور دسترسی به بینشی در مورد روش هایی که بیشتر در خالص سازی محصولات طبیعی آبزی استفاده می شوند 115 گزارش از این محصولات که در سال 1995 در روزنامه انجمن شمیمدانان آمریکا ، روزنامه شیمی آلی ، تتراهدرون و روزنامه محصولات طبیعی به چاپ رسیده بودند مورد بررسی قرار گرفتند . هر نشریه به طریق زیر طبقه بندی می شود:

شاخه ارگانیسم منبع .

طبقه ترکیبات شیمیایی گزارش شده.

روش حفظ ارگانیسم ( تازه / منحصر در مقابل خشک فریز کردن ) .

روش استخراج “ غیر قطبی ” حلال هایی مانند : CH2, CL2  ، هگزان ها ، استون ، ETAO 2 ، Eto2  ، تولئون ، اترنفت ؛ “ غیر قطبی و الکل ” هر یک از مواد فوق مخلوط با یک الکل ؛ “ الکل ” معمولاً اتانول ، متانول ، و یا ایزوپروپانول ؛ “ طرح پیچیده ” ؛ مانند استخراج متوالی و یا مخلوطهای غیر معمول خیلی پیچیده حلالها با “ آبی ”  100% آب یا مخلوطهای آب دیگر محلولها در حالی که آب بیش از 50% مخلوط را شامل باشد .

 روش مورد استفاده تقسیم حلال در صورت وجود این روش ها به طبقات زیر تقسیم می شوند :

الف “ ساده ” مانند یک تقسیم تک مرحله ای ( مثل یوتانول آب ) و یا تقسیم دو مرحله ای مانند ETOAC آب ) و به دنبال آن تقسیم بعدی فاز آبی با یوتانول.

ب) “ کوپکان ” شامل هر طرح واقعی ویا تغییر یافته کوپکان ( Kypchan ) که در آن درصد فاز آبی به طور متوالی تنظیم می شود.

ج ) “ پیچیده ” ( کمپکس ) : شامل هر طرحی که در آن یک توالی غیر معمول حلال ها و یا مخلوطهای کمپکس غیر معمول حلال ها استفاده می شوند مانند :

مخلوطهای هیپتان : ETOA : MEOH : CHCL3  : ACOH

که در جدا سازی با تزلیوین ها استفاده می شوند.

نوع کروماتوگرافی ستون باز ، درخششی ویا ستون خلاء. این ها به ژل سیلیکا ، فازهای پیوندی ( مانند  CN,Did, C-8 DDS ) ویا نفوذ ژل بر رزین های غیر عاملی تقسیم می شوند من جمله سیستم های کروماتوگرافی تقسیم و اندازه ه مانند ( SephadenLH- 20 ، SephadenLh- 60  ، Nsbels ، Bibeadssx-20 ، Sn-8 , sn-4 ، AMBERLIT EXAD – 2 ، XAD ، XAD- 7 ، ژل TSK- G3…S ) .

نوع روش HPLC مورد استفاده در صورت وجود این ها به فاز طبیعی ،‌فاز معکوس ( C-18 , C – 8, C-4 ) دیگر فازهای پیوندی مانند : ( NH2 , CN, DIOL ) ومواردی تقسیم می شوند که در آنها ترکیباتی از مثالهای فوق استفاده گردند.

 کروماتوگرافی مایع فشار میانی ( MPLc ) ، کروماتوگرافی جریان مخالف ( CCC ) ، و کروماتوگرافی لایه نازک تدارکاتی ( PILC )کدام یک استفاده می شوند.

 آیا هر یک از روش های دیگر نیز استفاده می شوند ( مانند  ترم سازی و بلور سازی ، تبادل آنیون / کاتیون ، فراصافی ) .

نتایج این بررسی در جداول 3-1 ارائه شده اند . جدول 1 : توزیع ترکیبات را در شاخه ها نشان می دهد.

جدول 2 – رایج ترین روش های خالص سازی شاخه های متفاوت رانشان می دهد . جدول 3 – رایج ترین روش های خالص سازی را  برای طبقات ترکیبات نشان می دد. تعدادی از نتایج حاصل عبارتند از :

نگهداری نمونه ها :

در 77 % گزارشات مواد تازه و منجمد استخراج شدند در 23 % گزارشات از ارگانیسم قبل از استخراج خشک فریز شد و یا در هوا خشک گردید.( دو نمونه ) .

استخراج :

رایج ترین حلال های استخراج عبارت بودند از الکل ها ( 46 % ) و یا مخلوطهای الکل و حلال های کم قطبی تر ( 25 % ) .

تقسیم سازی :

هیچ تقسیم حلالی در 28 % موارد استفاده نشد تقسیم های ساده در 41 % زمان انجام شدند. طرح های کوپکان ( kychan ) در 25 % زمان و طرح های کمپکس در 50 % زمان استفاده شدند.

کروماتوگرافی ستونی ( VCC ) ، درخششی ؤ و یا جاذبه باز ) :

الف ) در 10 % روندهای جداسازی از هیچ شکلی از کروماتوگرافی ستون باز استفاده نشد.

ب) در 65 % جداسازیها از فازهای ثابت ژل سیلیکا استفاده شد.

ج ) در 12 % جداسازیها از فازهای ثابت فاز پیوندی ( مانند CN1, DIOL , ODS ) استفاده شد .

د) در 10 % جداسازیها ازفازهای ثابت ،‌فاز پیوندی و ژل سیلیکا استفاده شد( یعنی مراحل چندگانه کروماتوگرافی ستونی استفاده گردید ) .

ذ ) در 46 % جداسازیها از کروماتوگرافی تراوش ژل بر رزین های غیر عاملی استفاده شد. LH – 20  در 42 % جداسازیها استفاده گردید .

ر) در 44 % جداسازیها فقط فازهای ثابت ، فاز معکوس و یا سیلیکا استفاده شد ( بدون کروماتوگرافی )

ز) در 13 % جداسازیها فقط از رزین های غیر عاملی استفاده شد مانند Sephadeax Lh – 20 ،

خ ) در 33 % جداسازیها از ترکیب کروماتوگرافی فاز پیوندی و یاسیلیکا وکروماتوگرافی بر رزین های غیر عاملی استفاده شد.

MPLC  در 90 % مطالعات استفاده شد.

CCC در 70 % مطالعات استفاده شد .

PTLC  در 10 % مطالعات استفاده شد.

 HPLC :

الف ) در 27 % جداسازیها از HPLC  استفاده نشد.

ب) در 60 % فقط فازهای ثابت فاز نرمال استفاده شد . ( مانندسیلیکا ) .

ج ) در 49 % فازهای ثابت ، فاز معکوس استفاده  شد. (PR-18, PR-8, PR-4 )   

د) در 10 % جداسازیهای چندگانه HPLC  بر فازهای ثابت ، فاز معکوس و طبیعی استفاده شد.

ذ) در 3 % دیگر فازهای پیوندی استفاده شدند . ( NH2 , DIOL , CN ).

ر) در 14 % مطالعات از دیگر روش های جداسازی استفاده شد مانند فرم سازی ، بلورسازی ، فراصافی و یا کروماتوگرافی تبادل آنیون / کاتیون .

1-1 : روش کلی مورد استفاده در HBOI :

این فصل یک طرح کلی است از روش کلی مورد استفاده در آزمایشگاه  مؤلف جهت خالص سازی کردن محصولات طبیعی دریایی. یک طرح در شکل 1 آمده است . در روش ها تمام جداسازیها در یک مقیاس کوچک انجام می شوند تا این که ترکیب خالص به طور تکرار پذیر جدا شود. تعدادی روش خالص سازی برای تضمین جداسازی مقام ترکیبات مورد نظر استفاده می شوند و مقام اجزاء یا سنجض زیستی ، ILC-  و یا HPLC ، NMR شناسایی می گردند . روند کلی ما شامل مراحل زیر است :

جمع آوری و شناسایی میدانی ارگانیسم آبزی.

استخراج اولیه ارگانیسم .

سنجش یبولوژیکی عصاره اسخراجی.

تقسیم جهت تأیید و غنی کردن فعالیت زیستی .

تعیین قطبیت محصولات طبیعی موجود در عصاره و یا derplicatixn ترکیبات معلوم.

 انتخاب اولین مرحله کروماتوگرافیک بر اساس قطبیت.

کروماتوگرافی بیشتر.

توسعه جداسازی یک HPLC درصورت امکان .

افزایش مقیاس جداسازی برای آزمایش بیشتر بیولوژیکی و یا تشخیص ساختار.

2- جمع آوری و ذخیره ارگانیسم های آبزی .

1-2 کنترل ارگانیسم های آبزی :

ارگانیسم های آبزی منبع هزاران محصول طبیعی مختلف هستند . بسیاری از این ترکیبات در سیستم های پستانداران بی نهایت سعی بوده اند. به عنوان مثال پالی توکسین که در ابتدا در زوآنتید Palythoa  toxica یافت شد یکی از مهمترین ترکیبات غیر پروتئینی کشف شد تا امروز می باشد . حوض جزر ومدی که در آن زوآنتید رشد می کند در شرحهای اولیه سعی تشخیص داده شد و دانشمندانی که با آن ارگانیسم کار می کردند بیمار شدند وعلائم شبیه آنفلونزا در طی مرحله جمع آوری وکارهای بعدی دیده شد.دیگر ترکیبات مانند میکا لامبد وآپلی سیاتوکسین بی نهایت مشکل ساز بودند آپلی سیاتوکسین همچنین دارای ویژگیهای قوی توسعه دهنده توموری است. به طور کل هنگام کار با هر ارگانیسم جدید ایمن تر آناست که فرض کنیم مقدار دقیق ترکیبات آبزی باید احتیاط و دقت کافی مبذول شود . وسیله محافظی مناسب ماننذ دستکش و یاحفاظ چشم بایدهمیشه استفاده شود. بسیاری از محققان ( مانند خود مؤلف) مواردی از ناراحتی شدید چشم داشته اندکه در کلی جمع آوری ارگانیسم ها به وجود آمده بود این در حالی بود که هیدروژنها واسفنج هایی مانند : Tedania   ignis    , VeoF : bularia  heitangere دارای مؤلفه های آزار دهنده زیادی هستند که باعث خارش و تشکیل دانه در بعضی افراد می گردند. به طور نمونه یک رویارویی با اسفنج NEOF : bularia  به تنهایی می تواند محققانی را که در آزمایشگاه مؤلف کار می کنند بر آن دارد تا همگام کار یا نمونه ها از دستکش استفاده کنند .