تحقیق جهش زایی آلودگی های مختلف هوایی (ذرات معلق)

خلاصه

در این فصل و فصل بعد به بررسی آزمایشاتی می پردازیم که در طی آنها، جهش زایی آلودگی های مختلف هوایی (ذرات معلق) مورد مطالعه قرار می گیرند. هدف از این فصل بررسی تاثیر آلودگی هوا بر روی جمعیت یک منطقه است. جهش زایی ترکیبات آلی جدا شده (EOM) از ذرات معلق توسط آزمایشهای مختلفی از جمله کشت سالمونتلا، متد ترمیم DNA در سلول های کبد موش و آزمون میکرونوکلئوس در موش، مورد بررسی قرار گرفته است. ذرات معلق از 13 ناحیه شانگهای در تابستان 92 جمع آوری شدند. با جداسازی اسید باز، ترکیبات به سه جز اسیدی، بازی و خنثی تقسیم می شوند. جز خنثی، توسط کروماتوگرافی خود به سه زیر جزء تقسیم می‌شود. القای جهش های بازگشتی در نمونه های زمستان بیشتر از نمونه های تابستان بود. جهش زایی های مستقیم و غیرمستقیم مورد بررسی قرار گرفتند. موتاژنی با موش TA98 سالمونلا شناسایی می شود و نه با موش TA100. بیشترین میزان جهش زایی در جزهای اسیدی، آروماتیک و قطبی از نمونه های تابستانی مشاهده شدند. نمونه‌های زمستانی فرق مشخصی با نمونه های تابستانی نداشتند. رابطه ای بین پراش منطقه‌ای EOMها بدست نمی آید ولی روابط زمانی و مکانی برای قوه جهش زایی ذرات معلق وجود دارد. تمامی روش های آزمایشگاهی به کار برده شده، در تمامی موارد پاسخ مثبت دادند.

مقدمه

شانگهای، یک شهر صنعتی در چین است که انواع کارخانجات مختلف در آن گردآورده اند. با آن که صنایع بزرگ و آلاینده به خارج شهر منتقل شده اند، ولی هنوز جمعیت و بالا بودن تعداد وسائط نقلیه، هوای این شهر را آلوده می سازد. در چند سال اخیر، سرطان ریه از مهم ترین عوامل مرگ و میر در هر دو جنس بوده است.

 البته علت اصلی سرطان ریه، مصرف دخانیات اعلام شده است ولی با این حال باید به دو پرسش پاسخ دهیم. اول اینکه تنها 36% از تمام سرطانها و 21% از مرگ ها ناشی از مصرف سیگار است، پس سیگار آن قدرها هم مهم نیست و باید فاکتومهای دیگری نیز وجود داشته باشد. دوم اینکه نسبت سرطان ریه در مردها به زنها 3:1 است در حالیکه نسبت سیگار کشیدن 7:1 می باشد. این اختلاف نیز قائدتاً ناشی از عوامل محیطی است.

تاثیرات آلودگی های هوای شهری در شهرهای مختلفی بررسی شده است. طی این بررسی ها، بعضی از محققان موفق به نشان دادن توانایی این ذرات در جهش زایی شدند. مطالعات اپیدیمیولوژیکی، به طور گسترده در 50 سال گذشته نشان می دهند که آلودگی هوا یکی از عوامل افزایش تعداد ابتلا به سرطان ریه است. جهش زایی هوا در مناطق مختلف متفاوت است چرا که بافت آب و هوایی هر منطقه باعث تغییر در میزان آلودگی هوا می شود. در ضمن منابع آلودگی هوا نیز در شهرهای مختلف متفاوت است. تعدادی از تحقیقات در شهر شانگهای چین نشان دادند که ذرات معلق در هوا توانایی جهش زایی دارند ولی رابطه مستقیمی بین آلودگی هوا و سرطان ریه، نشان داده نشد. در این فصل، سعی در روشن کردن نوع تاثیرات آلودگی بر روی موجودات زنده داریم.

بسیاری از آلاینده های آلی که بر روی سطح ذرات معلق می نشینند به عنوان سرطان را شناخته شده اند یا حداقل مورد ظن هستند. برای تعیین توانایی ترکیبات مختلف در تولید جهش یا سرطان، نمونه های زیادی از مناطق مختلف این شهر تهیه شدند. این نمونه برداری ها یک بار در ژانویه 1992 و بار دیگر در آگوست 1993 تکرار شدند. تاثیرات آن ها در سه سطح جهش در ژنها، تخریب ترمیم DNA و تغییرات کروموزومی بررسی شدند.

لوازم و روشها

- نمونه گیری و استخراج ترکیبات آلی

نمونه های ذرات معلق توسط سمپلرهای با حجم بالا که مجهز به فیلترهای 20cm*20cm جمع آوری شدند.13 منطقه برای نمونه برداری انتخاب شد که مشخصات و محل آنها در جدول و شکل 1 نشان داده شده است. نمونه های متعلق به 13 منطقه در یک زمان تهیه شدند.

وزن خشک فیلترها، قبل و بعد از نمونه گیری تعیین شد، تا وزن ذرات معلق جذب شده تعیین شود. فیلترها تک تک شده و محتویات آنها توسط محلول نیمه قطبی دی‌کلرومتان (DCM) استخراج شد (سونیکاسیون به مدت 45 دقیقه). محلول استخراج شده، یک بار دیگر فیلتر شده و به دو بخش تقسیم شد. یک بخش حرارت داده شد تا خشک شود، سپس در حلال دی متیل سولفوکسید (DMSO) تا غلظت مناسب حلشد. بخش دیگر با جداسازی اسید باز به سه قسمت: اسید، باز وخنثی تقسیم شد. قسمت خنثی خود به زیر جزء تقسیم شد که زیرا اجزا برحسب قطبیت دسته بندی شده بودند. این قسمت بندی توسط XAD-2 دزین- سیلیکاژل (با نسبت 1:1) در ستون کروماتوگرافی انجام می شود. ستون با هگزان، بنزن و متانول پر شده بود تا ترکیبات آلیفاتیک، آروماتیک و قطبی از یکدیگر جدا شوند. این قسمتها نیز تمامی خشک شده و پس از اندازه گیری وزن در DMSO حل شدند.

- متد سالمونتلا/ میکروزوم در تعیین جهش زایی

در این روش ترکیبات مختلف در مجاورت سوشهای جهش یافته سالمونتلاتیفی موریم قرار می گیرند و هر چه تعداد جهش های بازگشتی و کلونی های رشد کرده بیشتر باشد، ترکیب جهش زاتر است. در این آزمایش سوشهای سالمونتلا TA98 و TA100 مورد استفاده قرار گرفتند. دزهای مورد استفاده برای استخراج خام دو بازه 100-400 Mg و برای هر جز 200-1000 Mg تعیین شد و از این  بازه ها برای هر نمونه 3 دز متفاوت انتخاب شد. ترکیبات 2-استیل آمینوفلوئورن (2-AF)، 7 و 2-دی استیل- آمینوفلوئورن (2,7-AF) و سدیم آزید (SA) به عنوان کنترل نسبت به کار رفتند و پلیتها برای 48h در دمای 37 درجه قرار گرفتند. سپس کلنی های تشکیل شده نمایش شدند.

- سنتز DNA غیر به برنامه ریزی شده

سلول های تازه کبد موش در محلول DMEM به همراه 5% سرم بوین و هیدروکسی اوره (0.01M) قرار گرفتند. سلولهای موجود در محیط در حدود 106*1 سلول تنظیم شد. 1 میلی لیتر از سوسپانسیون سلولی به یک لوله آزمایش منتقل شد. 10 میکرکوری از تیمیدین- [3H] و غلظتهای مختلفی از نمونه های مورد مطالعه اضافه شدند. لوله در شیکر به مدت 3h در دمای 37 درجه قرار گرفت. سلولها توسط فیلترهایی جدا شده و مقدار تیمیدین- [3H] آنها تعیین شد.

- مدد میکرونوکلئوس

روش های باسن 7 تا 8 هفته و وزن 18-25g در این آزمایش مورد استفاده قرار گرفتند. این موش ها به 41 دسته پنج تایی دسته بندی شدند و هر یک بدین ترتیب مورد تیمار قرار گرفتند. (a) محلول کنترل منفی (b) مسیتوکین (کنترل مثبت) (c) غلظت های 100,20,4 میلی گرم در میلی لیتر نمونه های استخراج شده. سوشها هر 24 ساعت 1 بار مورد تزریق قرار می گرفتند. 6 ساعت پس از آخرین تیمار، موش ها قربانی شده و مغز استخوان آنها جدا و رنگ آمیزی شد و گسترش ها برای وجود هسته در گلبول قرمز مورد مطالعه قرار گرفتند.