مقاله تصفیه دیافیلتریشن

روشی موثر و سریع برای نمک زدایی یا تغییر بافر نمونه های بیولوژیکی

دیافیلتریشن روشی است که غشاهای فراپالایش (پالایش از لا به لای صافی ای که قادر به گذراندن ذرات بسیار و ریز میکروسکوپی باشد) را برای تغییر، جابجایی یا کم کردن غلظت نمک یا مواد حل شده در محلول که شامل پروتئین ها، پپتیدها، نوکلئیک اسید و مولکولهای دیگر می باشد، مورد استفاده قرار می دهد. که در این حال با انتخاب صافی‌های غشاء نفوذپذیر (تراوا) برای جداسازی اجزا محلول بسته به اندازه مولکول به کار می رود. یک غشا فراپالایش مولکول هایی را که بزرگتر از منافذ غشا هستند را در خود نگه می دارد، در حالی که مولکولهای کوچکتر مثل نمک و مواد محلول در آب که قابلیت نفوذپذیری %100 دارند، به راحتی از غشا عبور می دهد. در اینجا ما مفاهیم مربوط به غلظت پروتئینی و دیافیلتریشن را شرح داده و روش های مختلف اجرای دیافیلتریشن و تاثیر آنها روی مراحل زمان، حجم، ثبات و بازیافت را مقایسه می کنیم.

غلظت:

   مواد محلول از طریق غشایی که به عنوان تغلیظ یا ابقا (حفظ کردن) شناخته شده در محلول حفظ می شود. مواد محلول از درون غشایی می گذرند که صافی یا تراوش نامیده می شود. یک غشاء، براساس خصوصیت دفعش برای نمونه  ای که غلیظ می‌ شود، انتخاب می شود. طبق یک قاعده کلی، وزن مولکول برای غشاء (MWCO) باید rd3/1 تا th6/1 وزن، مولکولی باشد که از غشا عبور نمی کند. این یک ابقا کامل است. هر چند MWCO به آن نمونه (محلول) نزدیک تر باشد، تشکیل ضایعات کوچک هم در طول مراحل غلظت بیشتر می شود. میزان جریان غشا (میزان جریان صافی در هر واحد غشا) به اندازه منفذ ارتباط دارد. هر چه اندازه منفذ ها کوچکتر باشد، میزان سرعت جریان غشاء برای همان فشار به کار رفته، کمتر می شود. بنابراین وقتی غشایی برای غلظت/ تصفیه انتخاب می شود باید به عامل زمان در مقابل بازیافت توجه داشت. در بسیاری از کاربردهای بیولوژیکی، عامل بازیابی مهمتر از عامل زمان است. مرحله زمان همیشه می تواند با افزایش میزان سطح غشا به کار برده، کاهش یابد. شکل 1 نمونه

غلظت نمونه با تصفیه (دفیلتریشن)

در این نمونه غشا تصفیه‌ ای مناسبی قرار داده شده که مولکول های بزرگ را در خودنگه می دارد. فشار تا زمانی وارد می شود که نصف حجم محلول از غشا عبور کند. مولکولهای بزرگ در نصف حجم اصلی (محلول غلیظ) باقی می مانند که در این بخش نصف مولکول های نمک هم قرار دارند. تصفیه، نصف دیگر مولکول های نمک را در بر می گیرد و شامل هیچکدام از مولکولهای بزرگ نمی شود. بنابراین،  مولکول های بزرگ به عنوان مایع غلیظ می شوند و نمک خارج می شود. مولکول های نمک به تناسب حجم در غلظت، ثابت می ماند پس قدرت یونی محلول غلیظ شده نسبتاً ثابت باقی می ماند. قدرت یونی محلول غلیظ می تواند با «شستن» نمک باقیمانده کاهش یابد. این مرحله تصفیه نامیده می شود. مرحله رقیق سازی هم بسیار مهم است که بعد از مرحله غلظت، انجام می شود. در حالی که صافی خارج می شود، آب هم اضافه می شود اگر محلول شستشو، به جای آب، بافر دیگری باشد، نمک بافر جدید در نمک اولیه موجود در نمونه، جابجا خواهد شد.

2-1-1. تصفیه ناپیوسته- رقیق سازی مداوم (پی در پی):

در این روش ابتدا نمونه را با آب یا بافر دیگر، به حجم از پیش تعیین شده، رقیق می کنند. سپس نمونه رقیق شده با فراپالایش، غلیظ شده و به حجم اصلی اش بر می گردد. این مرحله آن قدر تکرار می شود تا زمانی که نمک، مواد حلال در محلول یا مولکول های کوچکتر خارج شوند. با هر مرحله رقیق سازی مداوم، مولکول های کوچک بیشتری خارج می شوند. همان طور که در شکل 2 نشان داده شده این نمونه معمولا با یک حجم مشخصی از بافر رقیق می شود (1DV). در صورتی که مخزن به اندازه کل حجم جا داشته باشد متناوباً چندین حجم می تواند به یکباره اضافه شود، رقیق سازی کم‌کم چسبندگی را کم می‌کند که این عامل ممکن است میزان جریان صافی را افزایش دهد.

تصفیه ناپیوسته- رقیق سازی مداوم

2-1-2.تصفیه ناپیوسته- کاهش حجم:

در این روش ابتدا نمونه با یک حجم از پیش تعیین شده غلیظ می شود و سپس محلول رقیق شده با آب یا بافر دیگری به حجم اصلی اش بر می گردد. این عمل آنقدر تکرار می شود تا نمک، مواد حلال در محلول و مولکول های ریز خارج شوند. با هر مرحله غلیظ سازی و رقیق سازی مولکول های ریز بیشتری خارج می شوند.

بعد از اینکه آخرین محلول بافر برای تکمیل مرحله رقیق سازی اضافه شد، نمونه ممکن است قبل از تجزیه یا مرحله بعدی تصفیه غلیظ شود. آخرین محلول به دست آمده بعد از تصفیه با هر روشی (کاهش حجم ناپیوسته x2 یا رقیق سازی مداوم) به اندازه همان حجم و غلظت شروع رقیق سازی است. غلظت نمک به طور مساوی در هر دو نمونه کاهش می یابد. هرچند حجم تصفیه بافر که با روش کاهش حجم به کار می رود نصف آن حجمی است که در رقیق سازی مداوم به کار می رود. این به خاطر، غلظت اولیه‌ای است که حجم را تا نصف کاهش می دهد. حجم تصفیه برابر با حجمی است که رقیق سازی انجام می گیرد بنابراین، نصف حجم نیاز می باشد. با این مورد به نظر می رسد که غلیظ سازی قبل از رقیق سازی با هر دو روش (تصفیه ناپیوسته یا تصفیه با حجم ثابت) باید حجم تصفیه بافر مورد نیاز را کاهش داده و زمان را هم حفظ کند. (هدر ندهد) در بیشتر موارد این حالت اتفاق می افتد. عاملی که ما آن را محاسبه نکردیم، سرعت جریان صافی است، که برابر با مرحله زمان است. همان طور که محلول تولید شده غلیظ میشود چسبندگی افزایش یافته و سرعت جریان صافی هم کاهش می یابد. سرعت جریان صافی عکس سرعت غلظت است.

                                        که در اینجا:                         

 = میزان سرعت جریان صافی                               = غلظت لایه ژله ای

= مقدار ثابت                                                       = غلظت بقاء (جریان حجم)

همان طور که غلظت محلول تولید شده (CB)  چند درصد افزایش می باید. و وابسته به خصوصیات مولکول های خاصی است که نمونه را می سازند، کل معادله هم تغییر می‌کند. بنابراین با وجودی که ممکن است برای رقیق سازی یک نمونه غلیظ، حجم کمتری در مقایسه با نمونه کم غلظت به کار می رود. ولی از لحاظ زمانی زمان بیشتری طول می کشد. برای سادگی کار نمونه های بالا، شیوه جریان صافی مثل غلیظ کننده سانتریفوژ به کار می رود.

تصفیه:

  روش های مرسوم که برای خارج کردن نمک یا تغییر بافر به کار می آیند، مثل دیالیز غشاء و کرو.ماتوگرافی ژل تراوا می تواند موثر باشد. ولی محدودیت هایی دارد. روش های دیالیز تا چندین روز طول می کشد، حجم زیادی آب را برای تعادل نیاز دارد و به خاطر تهیه مخزن های دیالیز با دست، کاری ریسکی است. کروماتوگرافی ژل تراوا که ناشی از رقیق سازی نمونه است، اغلب برای برگشت غلظت به حالت قبلی نیاز به یک مرحله تصفیه اضافی دارد. که اضافه کردن این مرحله به مراحل دیگر هم ریسک است، چون ممکن است در نمونه ضایعات یا آلودگی ایجاد کند. با عمل رقیق سازی می توان خارج کردن نمک یا مواد محلول دیگر را همچون تغییر بافر، سریع و آسان انجام داد مزیت مهم دیگر رقیق سازی این است که نمونه روی همان سیستم غلیظ می شود، و ریسک ضایعات و آلودگی نمونه را کم می‌کند.

چندین روش برای انجام رقیق سازی وجود دارند، در حالی که نتیجه کار ممکن است یکی باشد ولی زمان و حجم مورد نیاز برای تکمیل مرحله ممکن است به طور قابل توجهی تغییر کند. تشخیص تفاوت روش های به کار رفته زمانی که یکی بعد از دیگری به کار می روند،حائز اهمیت است.

2-1-3. تصفیه پیوسته:

 روش تصفیه (که به تصفیه حجم ثابت هم معروف است) شامل شستشوی نمک های بافر اصلی (یا انواع مولکول های کم وزن تر) در نمونه ابقا که با اضافه کردن آب یا بافر جدید به محلول ابقاء که با همان میزان صافی تولید شده است می باشد. در نتیجه، حجم محلول ابقاء و غلظت تولید شده در طول مراحل تصفیه تغییر نمی کند. اگر آب برای تصفیه به کار رود، نمک ها شسته شده و قدرت رسانایی کاهش می یابد. اگر یک محلول بافر برای رقیق سازی به کار رود، غلظت نمک محلول بافر جدید به طور معکوس در تناسب افزایش می یابد. میزان نمک خارج شده، متناسب با ححم محلول ابقاء به حجم تصفیه تولید شده مربوط می شود. حجم تصفیه تولید شده معمولا به حجم تصفیه معروف است. حجم تصفیه (DV)، همان حجم محلول ابقاء در زمان شروع تصفیه است. برای تصفیه پیوسته، مایع به همان میزانی که محلول تصفیه تولید شده، اضافه می شود. وقتی حجم محلول تصفیه شده به اندازه حجم محلول ابقاء باشد، مرحله 1DV به دست می آید. با استفاده از روش تصفیه پیوسته، بیش از %5/99 از %100 محلول نفوذ پذیر می تواند با شستشو از بین 6 حجم محلول ابقاء خارج شود.