مقاله سیر تحویل تصفیه و تخلیص سرم های درمانی

در اوایل سرم های درمانی که توسط پادزهر اسب تهیه می شد به صورت خام به مصرف می رسید. بدین ترتیب که پس از تزریق دزهای معینی از زهر به بدن حیوان و اندازه گیری میزان پادزهر تولید شده، عمل خون گیری از اسب انجام قرار می گرفت.

سپس خونهای گرفته شده در استوانه های شیشه ای که داخل سرپوش فلزی آنها وزنه سربی آویزان شده بود، می گرفت.

چند ساعت پس از خونگیری وزنه سربی به آ‎رامی رها می گردید و خونابه به تدریج در ظرف یک تا دو روز جدا می شد و این وزنه با فشار روی لخته مقدار بیشتری سرم را مجزا می کرد، سپس سرم شفاف و عاری از گویچه ها را به کمک سیفون خارج کرده و با افزودن مقداری فنل محلول در اتر، سرم را برای چند ماه تا یک سال در سردخانه رها می کردند. در این مدت مقدار زیادی آلبومین و پروتئین های غیر اختصاصی رسوب می‌کرد و پس از حذف رسوبات، سرم شفاف را پس از تعیین عیار به حجم های حدودی 500 تا 1000 واحد بین المللی تقسیم نموده و پس از تأیید آزمایش های لازم سترونی و بی ضرری و حسن اثر، محصول نهایی آماده عرضه و مصرف پزشکی می‌گردید.

چنین سرمی طبعاً دارای آلبومین ها و پروتئین های غیر اختصاصی سرم اسب بود و ناگزیر بدن بیمار پس از تزریق نسبت به تمامی پروتئین های موجود در سرم اسب حساس می شد و استفاده از سرم اسبی برای بار دوم معمولا با عوارض و آلرژی توأم بود.

از این رو در دهه های قبل از جنگ جهانی دوم مسئله تصفیه سرم و تخلیص آن بسیار مورد توجه بود.

روش های متعددی برای تصفیه سرم به کار گرفته شده بود که در زیر به پاره ای از آن ها به طور اختصار اشاره می شود.

در سال 1903 در انگلستان ایمری[1] مسئله تصفیه سرم با آنزیم ها را مطرح کرد ولی از کار او استقبال زیادی نشد. چرا که به ازای از بین رفتن پروتئین های غیر اختصاصی پاره ای از پروتئین های اختصاصی هم از بین میر فت. در سال های 1939-1936 پارفنچف[2] دانشمند لهستانی بررسی های جالبی در ضمیمه تصفیه سرم به کمک پپسین و سولفاتها در آمریکا به ثبت رساند.

در سال 1954 در انگلستان ککویک[3] و همکاران آنها از اتر به عنوان رسوب دهنده پروتئین ها استفاده نمودند.

بنزهاف[4] نیز روشی را ارائه کرد که با دناتوراسیون حرارتی و Salting out کار تصفیه صورت می گرفت.

سیستم سولفات سدیم هاوو[5] که با افزایش تدریجی غلظت سولفات سدیم در پلاسما بود نیز یکی از روش  های تصفیه بود.

سیستم سولفات آمونیوم وودورث[6] هم تا قبل از سیستم تصفیه با اتانل سرد یکی از کارآمدترین روش های تصفیه سرم درمانی بود.

بعدها کوهن روش اتانل سرد را ابداع کرد که جامع ترین روش در آمریکا بود، در این روش با تغییر غلظت الکل اتیلیک در سرما پروتئین های پلاسما به پنج جزء اصلی تقسیم می شوند. مزیت استفاده از این روش این است که به آسانی می توان موقع خشک کردن گلوبولینها با تبخیر آزاد کرده و برطرف شوند و عیب این روش هم این است که تمامی این مراحل باید در سرما انجام شود. و عده ای از پروتئین های پلاسما پس از تماس دائم با الکل خاصیت ابتدایی خود را از دست می دهند و بی ثمر می شوند.

تصفیه و تخلیص سرم های درمانی:

از میان تکنیک های متعدد تصفیه و و تخلیص پروتئین ها، روش های رسوبی متداولترین و با سابقه ترین روش جداسازی پروتئین های پلاسما محسوب می شوند که در مقیاس وسیع جهت تولید فرآورده های بیولوژیک مانند سرم های درمانی کاربرد داشته اند.

در جداسازی پروتئین های پلاسما با تکنیک های رسوبی میزان حلالیت دارای اهمیت می باشد که به خصوصیات حلال و سایر اجزا مخلوط پلاسما مربوط است.

مهمترین عوامل موثر بر  حلالیت پروتئین ها عبارتند از: PH ، قدرت یونی، دما و ثابت دی الکتریک

رسوب دادن با تغییر PH:

   یکی از ساده ترین روش های جداسازی پروتئین ها به طریقه تنظیم PH محلول در نقطه ایزوالکتریک[7] پروتئین مورد نظر برای ایجاد رسوب می باشد.

ولی از این روش برای خارج کردن پروتئین های نامطلوب از مخلوط استفاده می شود. و برای رسوب دادن پروتئین ها به دلیل احتمال دناتوره شدن پروتئین ها کاربرد ندارد.

رسوب دادن توسط کاهش قدرت یونی:

برخی از پروتئین ها را می توان با کاهش قدرت یونی رسوب داد ولی از آنجا که برای این کار باید به محلول پروتئین ها آب اضافه شود، لذا با کاهش غلظت پروتئین های محلول، افزایش حلالیت آنها دور از انتظار نیست. از این رو این روش اغلب در مراحل پایانی خالص سازی، که غلظت پروتئین ها در محلول به قدر کافی افزایش یافته، استفاده می شود.

رسوب دادن با افزایش قدرت یونی:

پدیده Salting out شالوده تعدادی از تکنیک های مهم جداسازی و تخلیص پروتئین هاست که با ایجاد غلظت بالایی از نمک خنثی در محلول پروتئینی و رسوب دادن بخشی از پروتئین ها موجب تفکیک و خالص سسازی و تغلیظ آنها می گردد و از رایج ترین روش های جداسازی به طریقه رسوبگیری به شمار می رود.

مطالعه پدیده Salting out پروتئین های سرم به کمک آنالیز و سانتریفوژ نشاندهنده تاثیر پیچیده نمک روی پروتئین ها است.

مشخص شده است که بین حلالیت نمک و تاثیر آن در رسوب پروتئین ها رابطه مستقیم وجود دارد. این ایده مبنای نظریه دبای[8] در توجیه پدیده مذکور می باشد که به بیان ساده می گوید:

یون های نمک اکثر ملکول های قطبی محیط (حلال) را به طرف خود جذب کرده و اطراف مولکول های پروتئین از آنها خالی می گردد و متعاقباً بدنبال برخورد های تصادفی مولکول های پروتئین با یکدیگر تجمع مولکولی ایجاد و رسوب تشکیل می شود.

هرگاه نمک به محیط اضافه شود مولکول های حلال قطبی از اطراف پروتئین به طرف یون های نمک جذب می شود و مولکول های پروتئین به طور تصادفی در مجاورت یکدیگر قرار می گیرند، در حالی که لایه آب به شکل موثر وجود ندارد تا مانع جذب آنها به یکدیگر شود، در نتیجه تجمع یافته و تشکیل رسوب می دهند.

    پروتئین های بزرگتر که سطح بیشتری دارند (مولکول هایی با گروههای غیر قطبی) با مقادیر نمک کمتری رسوب می کنند و مولکول های کوچکتر که گروههای غیر قطبی کمتری دارند در غلظت های زیادتر نمک رسوب می نمایند.