اثر وزن مولکولی و DD کیتین و کیتوسان روی فرآیند ترمیم زخم
خلاصه :
در این مقاله اثر کیتین و کیتوسان روی فرآیند ترمیم زخم ها و برش های خطی در موش ها بررسی شده است . تحکام شکاف زخم در گروههای کیتوسان (cos),D-glucosamine (GLcNAc)] N-acetyl –D-glucosamine و Chiti – aligosaccharide (NACOS) و کیتین ) بیشتر بود .
فعالیت آنزیم های کلاژناز هم در گروه های کیتوسان بیشتر از گروههای کتین است .
میزان تغییرات در مورد تجمع و استحکام و فعالیت آنزیم های کلاژ ناز در نمونه های مختلف زیاد نبود.
دریافته های بافت شناسی رشته های کلاژن به صورت عمود بر خط برش در گروه های (NACOS,COS) رشد کردند و در گروههای کیتوسان تعدادی فیبروبلاست فعال شده در اطراف زخم دیده شد.
در DD های بالا استحکام خط برش ترمیم یافته بیشتر است مچنین سمیزان فیبروبلاست های ظاهر شده اطراف زخم .
مقدمه :
کیتین و کیتوسان تعدادی خواص بیولوژیکی مفید در کاربرد هایی نظیر : 1- پوشش زخم ها 2- زیست سازگاری بالا 3-قابلیت زیست ستخریب پذیری 4- عامل انعقاد خون 5- عامل ضد عفونت 6- عامل تسریع در ترمیم زخم در این تحقیق روی اثر کیتین و کیتوسان روی ترمیم زخم کار شده و بهایننتیجه رسیده که این موارد ست های ترمیم و سلول های (PMN) Polymorphonuclear و فیبروبلاست ها و سلول های اندوتلیال رگ ها را فعال می کنند .
وقتی کیتین و کیتوسان در بدن استفاده می شوند توسط آنزیم های کیتیناز و کیتوساناز خریب می شوند و متعاقباٌ به متومر و الیگومر هایشان تبدیلمی شوند .
در تحقیقات گذشته ثابت شده که نه تنها کیتین و کیتوسان بلکه ایگومرها و منومرهای آنها نیز روی مهاجرت سلول های ساندوتلیان و فیبروبلاست ها اثر دارد و منومرها و الیگومرهای آنهابر روی ترمیم زخم ها در محیط in-vivo موثرند . هر چند که رابطه بین خواص شیمیایی و کیتین و کیتوسان و ترمیم زخم هستند شناخته نشده است .
در تحقیق حاضر کیتین و کیتوسان با وزن های مولکولی مختلف و DD های مختلف آماده شده اند و اثر آنهاروی ترمیم زخم های برشی ایجاد شده در موشها آزمایش شده . و همچنین استحکام زخم ترمیم شده و میزان آنزیم کلاژناز در بافت هم اندازه گیری شده که این دو عنوان شاخص برای ترمیم زخم هستند .
آزمایشات :
در این تحقیق تین و کیتوسان توسط شرکت Sunfive + ژاپن ساخته شه است
کیتین ( باوزن مولکولی 300KD ) و کیتوسان ( با وزن مولکولی 80KD ) ا میانگین سایز 5/3 میکرو متر بوسیله اکسید اتیلن استریل شدند و در محلول بافر فسفات ( PBS با PH=7/2 ) با غلظت 10 میلی گرم بر میلی لیتر معلق می شوند .
کیتین و کیتوسان به ترتیب شامل DD های کمتر از 10 درصد و بیشتر از 80 درصد هستند .
NACOS و COS به ترتیب از ترکیب [GLcNAcNAc5] و [GLCN1, GLCN6] بدست آمده اند .
الیگومرها و منومرها در محلول PBS با غلظت 10 میلی گرم بر میلی لیتر حلشدند و از فیلترهای با روزنه های 45/0 میکرو متر عبور کرده و استریل شدند .
هر نموه با غلظت 1/0 تا 10 میلی گرم بر میلی لیتر با PBS تنظیم شد.
چهار نمونه مختلف deacetylation شده کیتین (dac) ( با 14% و 23% و 63% و 96% ) یک وزن مولکولی یکسان (50KD) بوسیله شرکت Sunfive تهیه شده و بصورت پودری با میانگین سایز 6 تا 8 میکرومتر استرل شده و به همان روش تنظیم کیتین و کیتوسان تنظیم شده است .
پودر ها با DD 100% رابا (DAC100) نشان می دهند .
وزن مولکولی هم در این تحقیق توسط روش viscosity تعیین شده
DD هم در این تحقیق سط روش IR و یا روش colloidal titration تعسسن شده .
طرح آزمایش :
از 72 عدد موش مؤنث Wistar ( با وزنی حدود 300+20gr ) در این تحقیق استفاده شده است .
بعد از اینکه موهای پشت موشها کنده شد و آن قسمت با ید ضد عفونی شد 2 زخم برشی ضخامتکامل (با طول 4 سانتی متر ) در حالت بی هوشی با چاقوش جراحی روی پشت موش ها ایجاد می شود .
بعد از اینکه حونریزی بند آمد با 100 میکرولیتر از هر نمونه زخم شتسشو داده می شود و سپس زخم با بخیه هایی از جنس Stainless Steel بخیه می شوند . هفت روز بعد از جراحی حیوانات انانازی (کشته) می شوند و از بافت پوست در محل زخم نمونه برداری می شود .
در آنالیز استحکام زخم بهبود یافته یک نوار از پوست ( با 1س سانتی متر عرض و 2 سانتی متر طول ) از وسط محل زخم در هر نمونه برداشته می شود .
حداکثر استحکام تا زمانی که پوست از محل برش ه شود با lood gauge و کشش سنج اندازه گیری شود .
Data های بدشت آمده به سطح مؤثر تقسیم شده ( 5 میلی متر از خط برش در هر نمونه ) و در آخر بر حسب نیوتون بر میلی متر مربع بیان شده (N/mm2) در دیگر نمونه ها ( نمونه های دوم ) میزان آنزیم کلاژ ناز با دستگاه اندازه گیری کلاژ نوع I ازه گرفته شد و مشاهدات بافت اسی ز انجام . و بالاخره میزان آنزیم کلاژ ناز فعال با واحد Unit/mg پروتئین بافت بیان می شود .
نتایج و تحلیل ها :
اثر وزن مولکولی روی استحکام بهبود یافته و فعالیت آنزیم کلاژناز :
اثر وزن مولکولی روی استحکام زخم بهبود یافته در شکل 1 نسان داده شده است . استحکام زخم بهبود یافته در همه نمونه ها افزایش قابل توجه ای در مقایسه بانمونه شاهر (Saline) داشت . در گروه کیتین ( شامل : کیتین GlCNAc , NACOS ) و کیتوسان ( شامل : کیتوسان و GLCNAC ) و کتیسان و GLCN و COS ) بیشترین تأثیر مربوط به الیگومر ها (NACOS , COS ) بوده و قتی گروههای کتین و گروههای کتیوسان با هم مقایس شدندنشان داده شد که گروههای اثر بیشتری دارند از گروههای کیتین در یک وزن مولکولی یکسان اثر وزن مولکولی روی فعالیت آنزیم کلاناژ در شکل 2 نشان داده شده است .
فعالیت آنزیم کلاناژ در همه نمونه ها افزایش قابل توجه ای در مقایسه شاهد (saline) داشت . در گروههای کیتوسان منومر (GLCNAC , GLCN) این فیبرها به صورت موازی با خط برش رشد می کنند این تحقیق شان می دهد که نه تنها کیتین و کیتوسان بلکه منومرها والیگومرهای آنها نیز سرعت ترمیم زخم را افزایش می دهند . در گزارشاتقبلی نشان داده شده که کیتین و کیتوسان سرعت ترمیم زخمرا افزایش می دهند . هر چند کهاین قضیه کاملاٌآشکار نیست به هر صورت کیتین و کیتوسان مستقیماٌ اثر می گذارند برای اینکه آنهابوسیله خی از آنزیم هابه مونومرها و الیگومرهایشان در محیط زخم تخریب می شوند .