اثر وزن مولکولی و DD کیتین و کیتوسان روی فرآیند ترمیم زخم خلاصه : در این مقاله اثر کیتین و کیتوسان روی فرآیند ترمیم زخم ها و برش های خطی در موش ها بررسی شده است .
تحکام شکاف زخم در گروههای کیتوسان (cos),D-glucosamine (GLcNAc)] N-acetyl –D-glucosamine و Chiti – aligosaccharide (NACOS) و کیتین ) بیشتر بود .
فعالیت آنزیم های کلاژناز هم در گروه های کیتوسان بیشتر از گروههای کتین است .
میزان تغییرات در مورد تجمع و استحکام و فعالیت آنزیم های کلاژ ناز در نمونه های مختلف زیاد نبود.
دریافته های بافت شناسی رشته های کلاژن به صورت عمود بر خط برش در گروه های (NACOS,COS) رشد کردند و در گروههای کیتوسان تعدادی فیبروبلاست فعال شده در اطراف زخم دیده شد.
در DD های بالا استحکام خط برش ترمیم یافته بیشتر است مچنین سمیزان فیبروبلاست های ظاهر شده اطراف زخم .
مقدمه : کیتین و کیتوسان تعدادی خواص بیولوژیکی مفید در کاربرد هایی نظیر : 1- پوشش زخم ها 2- زیست سازگاری بالا 3-قابلیت زیست ستخریب پذیری 4- عامل انعقاد خون 5- عامل ضد عفونت 6- عامل تسریع در ترمیم زخم در این تحقیق روی اثر کیتین و کیتوسان روی ترمیم زخم کار شده و بهایننتیجه رسیده که این موارد ست های ترمیم و سلول های (PMN) Polymorphonuclear و فیبروبلاست ها و سلول های اندوتلیال رگ ها را فعال می کنند .
وقتی کیتین و کیتوسان در بدن استفاده می شوند توسط آنزیم های کیتیناز و کیتوساناز خریب می شوند و متعاقباٌ به متومر و الیگومر هایشان تبدیلمی شوند .
در تحقیقات گذشته ثابت شده که نه تنها کیتین و کیتوسان بلکه ایگومرها و منومرهای آنها نیز روی مهاجرت سلول های ساندوتلیان و فیبروبلاست ها اثر دارد و منومرها و الیگومرهای آنهابر روی ترمیم زخم ها در محیط in-vivo موثرند .
هر چند که رابطه بین خواص شیمیایی و کیتین و کیتوسان و ترمیم زخم هستند شناخته نشده است .
در تحقیق حاضر کیتین و کیتوسان با وزن های مولکولی مختلف و DD های مختلف آماده شده اند و اثر آنهاروی ترمیم زخم های برشی ایجاد شده در موشها آزمایش شده .
و همچنین استحکام زخم ترمیم شده و میزان آنزیم کلاژناز در بافت هم اندازه گیری شده که این دو عنوان شاخص برای ترمیم زخم هستند .
آزمایشات : در این تحقیق تین و کیتوسان توسط شرکت Sunfive + ژاپن ساخته شه است کیتین ( باوزن مولکولی 300KD ) و کیتوسان ( با وزن مولکولی 80KD ) ا میانگین سایز 5/3 میکرو متر بوسیله اکسید اتیلن استریل شدند و در محلول بافر فسفات ( PBS با PH=7/2 ) با غلظت 10 میلی گرم بر میلی لیتر معلق می شوند .
کیتین و کیتوسان به ترتیب شامل DD های کمتر از 10 درصد و بیشتر از 80 درصد هستند .
NACOS و COS به ترتیب از ترکیب [GLcNAcNAc5] و [GLCN1, GLCN6] بدست آمده اند .
الیگومرها و منومرها در محلول PBS با غلظت 10 میلی گرم بر میلی لیتر حلشدند و از فیلترهای با روزنه های 45/0 میکرو متر عبور کرده و استریل شدند .
هر نموه با غلظت 1/0 تا 10 میلی گرم بر میلی لیتر با PBS تنظیم شد.
چهار نمونه مختلف deacetylation شده کیتین (dac) ( با 14% و 23% و 63% و 96% ) یک وزن مولکولی یکسان (50KD) بوسیله شرکت Sunfive تهیه شده و بصورت پودری با میانگین سایز 6 تا 8 میکرومتر استرل شده و به همان روش تنظیم کیتین و کیتوسان تنظیم شده است .
پودر ها با DD 100% رابا (DAC100) نشان می دهند .
وزن مولکولی هم در این تحقیق توسط روش viscosity تعیین شده DD هم در این تحقیق سط روش IR و یا روش colloidal titration تعسسن شده .
طرح آزمایش : از 72 عدد موش مؤنث Wistar ( با وزنی حدود 300+20gr ) در این تحقیق استفاده شده است .
بعد از اینکه موهای پشت موشها کنده شد و آن قسمت با ید ضد عفونی شد 2 زخم برشی ضخامتکامل (با طول 4 سانتی متر ) در حالت بی هوشی با چاقوش جراحی روی پشت موش ها ایجاد می شود .
بعد از اینکه حونریزی بند آمد با 100 میکرولیتر از هر نمونه زخم شتسشو داده می شود و سپس زخم با بخیه هایی از جنس Stainless Steel بخیه می شوند .
هفت روز بعد از جراحی حیوانات انانازی (کشته) می شوند و از بافت پوست در محل زخم نمونه برداری می شود .
در آنالیز استحکام زخم بهبود یافته یک نوار از پوست ( با 1س سانتی متر عرض و 2 سانتی متر طول ) از وسط محل زخم در هر نمونه برداشته می شود .
حداکثر استحکام تا زمانی که پوست از محل برش ه شود با lood gauge و کشش سنج اندازه گیری شود .
Data های بدشت آمده به سطح مؤثر تقسیم شده ( 5 میلی متر از خط برش در هر نمونه ) و در آخر بر حسب نیوتون بر میلی متر مربع بیان شده (N/mm2) در دیگر نمونه ها ( نمونه های دوم ) میزان آنزیم کلاژ ناز با دستگاه اندازه گیری کلاژ نوع I ازه گرفته شد و مشاهدات بافت اسی ز انجام .
و بالاخره میزان آنزیم کلاژ ناز فعال با واحد Unit/mg پروتئین بافت بیان می شود .
نتایج و تحلیل ها : اثر وزن مولکولی روی استحکام بهبود یافته و فعالیت آنزیم کلاژناز : اثر وزن مولکولی روی استحکام زخم بهبود یافته در شکل 1 نسان داده شده است .
استحکام زخم بهبود یافته در همه نمونه ها افزایش قابل توجه ای در مقایسه بانمونه شاهر (Saline) داشت .
در گروه کیتین ( شامل : کیتین GlCNAc , NACOS ) و کیتوسان ( شامل : کیتوسان و GLCNAC ) و کتیسان و GLCN و COS ) بیشترین تأثیر مربوط به الیگومر ها (NACOS , COS ) بوده و قتی گروههای کتین و گروههای کتیوسان با هم مقایس شدندنشان داده شد که گروههای اثر بیشتری دارند از گروههای کیتین در یک وزن مولکولی یکسان اثر وزن مولکولی روی فعالیت آنزیم کلاناژ در شکل 2 نشان داده شده است .
فعالیت آنزیم کلاناژ در همه نمونه ها افزایش قابل توجه ای در مقایسه شاهد (saline) داشت .
در گروههای کیتوسان منومر (GLCNAC , GLCN) این فیبرها به صورت موازی با خط برش رشد می کنند این تحقیق شان می دهد که نه تنها کیتین و کیتوسان بلکه منومرها والیگومرهای آنها نیز سرعت ترمیم زخم را افزایش می دهند .
در گزارشاتقبلی نشان داده شده که کیتین و کیتوسان سرعت ترمیم زخمرا افزایش می دهند .
هر چند کهاین قضیه کاملاٌآشکار نیست به هر صورت کیتین و کیتوسان مستقیماٌ اثر می گذارند برای اینکه آنهابوسیله خی از آنزیم هابه مونومرها و الیگومرهایشان در محیط زخم تخریب می شوند .
در این تحقیق ثابت شدهکه ذات تخریب پذیری کیتین و کیتوسان بر روی ترمیم رخم تأثیر گذار است .
الیومرها تأثیر بیشتری دارن .
در مشاهدات بافتی نشان داده شده که فیبرهای کلاژنی در نمونه های الیگومری به صورت عمود بر خط برش نمی توانند رشد کنندکه بهترمیم زخم سرعت بدهند .
نمی توان به درستیتوضیح داد که چرا الیگومرها اثر بیشتری بر روی ترمیم زخم دارند .
با وجود این یک جواب مطرح است : وقتی هر نمونه با سایز مولکولی کم .
به ع لاوه الیگومرها هم از این مولکولی بالا.
در حالی مترمرها به سرعت جذب می شوند به علت وزن مولکولی کم به علاوه الیگومرها هم از هم این جهت مناسب هستند.
نه فقط کتینین و کیتوسان بلکه الیگومرها و منومرهایشان هم فعالیت انزیم کلافاز را ا فزایش ki می دهند.
فعالیت انزیم کلا ناز با تغییر شکل زخم در طی فرآیند ترمیم زخم رابطه دارد.
این آنزیم به طور عمده توسط فیبروبلاست ها و سلول های التهابی تولید می شوند.
در مشاهدات بافت شناسی فیبرو پلاست های بیشتر و سلول های التهابی کمتری در اطراف زخم دیده شده که نشان دهنده این است که فیبروپلاست ها به طور عمده آنزیم کلافاز را تولید می کنند.
این پدیده به این معنی است که کیتین و کیتوسان و مواد حاصل از تخریب آنها بر روی شکل زخم در طی فرآیند ترمیم زخم تاثیر می گذارند.
تحقیقاتی کلینیکی وجود دارد که نشان می دهد که جای زخم در حضور کیتین و کیتوسان به حداقل میزان خود می رسد.
در این تحقیق رنج رسوب همه ن مونه ها از 1/0 تا 10 میلی گرم بر میلی لیتر ترمیم زخم و فعالیت آْنزیم کلافاز را افزایش داد.
این پدیده پیشنهادی کند که نمونه در میزان رسوب کمتر ممکن است در ترمیم زخم موثر باشد.
در تحقیق از نمونه ها با میزان رسوب کمتر ممکن است در ترمیم زخم موثر باشد.
در تحقیقات گذشته این نتیجه حاصل شده است که کیتین با وزن 1/0 میلی گرم و کیتوسان با وزن 01/0 میلیگرم باعث رشد بافت در محیط in-vivo می شوند.
در این تحقیق از نمونه ها با میزان رسوب 1/0 تا 10 میلیگرم بر میلی لیتر ا ستفاده شده و 1/0 میلی لیتر از هر نمونه روی زخم ها قرار داده شده (4 سانتر متر x 1 سانتی متر سطح زخم) کمترین وزن هر نمونه 01/0 میلی گرم (10 میکروگرم) است.
نویسنده این تحقیق فکر کرده که این وزن معقول ا ست و سپس این ازمایش را طراحی کرده است.
در نتیجه همه غلظت ها برای تسریع بهبود زخم کافی هستند بنابراین باید اثر غلظت های کمتر هم بررسی شود.
اثر DD روی استحکام زخم های بهبود یافته و فعالیت کلا‍ژفاز: تجدول 1 اثر DD را روی استحکام زخم های بهبود یافته و فعالیت کلافاز را نشان می دهد.
حد هر دو پارامتر در همه نمونه ها افزایش قابل توجه ای نسبت به نم ونه شاهد دارد.
هر چه DD بیشتر باشد ا ستحکام زخم بهبود یا فته و فعالیت آنزیم کلافاز بیشتر است.
و همچنین در مطالعات بافت شناسایی در DD های بالا فیبروپلاست های فعال شده بیشتری مشاهده شده است.
(شکل 5 و 6) در این تحقیق اثر DD روی سرعت بهبود زخم اثبات شده است در نتیجه ما فرض می کنیم که آمینوهای باقی مانده با قدرت و سرعت ت رمیم زخم را بازگو می کنند مطالعات بافت شناسی فیبروپلاست های فعال بیشتری نشان داده است.
در سال 1986 توسط Nishimura و Ishihara و همکارانشان گزارش شده که 70 درصد کیتین deacetylation شده بیشترین اثر را روی فعالیت ماکروفاژها د ارد.
Suzuki در سال 1997 نشان داد که DD بالاتر کیتین یک فعالیت تکمیلی قوی رادر مقایسه با نمونه ای با DD کمتر دارد .
نتیجه این تحقیق با تحقیقات ته سازگار است .
در آینده مطالعه رابطه آمپنوهای باق مانده با فعالیت فیبروبلاست ها لازم است .
نتیجه : وه برکیتین و کیتوسان منومرها و الیگومرهای آنها هم فرآیند ترمیم زخم را تسریع می کنند .
استحکام زخم بهبود یافته و فعالیت آنزیم کلاژناز در گروههای کیتوسان س بیشتر از گروههای کیتین است .
دربافته های بافت شناسی کلاژن در جهت عمود بر خطذ برش در گروههای الیگوساکاریدها (NACOS,CAS) و تعدای فیبروبلاست های فعال شده در اطراف زخم در گروههای کیتوسان نشان داده شده اتس .
در مورد DD : هرچه DD بالاتر باشد استحکام زخمبهبود یافته فیبرو بلاست سها افزایش بیتری را نشان می دهد .