دانلود تحقیق ماندگاری و بقای میکروارگانیزم ها در روغن زیتون تصفیه نشده

مقدمه: روغن زیتون از خرد شدن کامل میوه در طی فرآیندهای جداسازی متوالی از بخش روغنی آن طی عمل سانتریفوژ بدست می آید.

روغن زیتون تصفیه‌نشده (virgin) تازه دارای مواد جامد معلق ومقداری ازشیره گیاهی است که میزان آن براساس گونه های مختلف و میزان تکامل و رسیده بودن میوه و روش‌های فرآوری روغن متفاوت است.

با این وجود، کیفیت روغن زیتون در حین نگهداری بهبود می‌یابد.

وقتی مواد جامعد معلق موجود در روغن رسوب می‌کنند روغن شفافیت بهتری یافته و لذا طعم جدیدی می‌گیرد.

در همین زمان، فرآیندهای تجزیه کنندگی که در تشکیل ترکیبات فنولی دخیل می باشند، روی می دهند.

در حقیقت، ،طعم تلخ روغن زیتون جدیداً تولید شده طی زمان نگهداری از بین می رود زیرا گلوکوسیدی تحت عنوان oleuropein تبدیل به ترکیبات ساده تری می شود که دیگر تلخ نیستند.

تاکنون اکثر تحقیقات انجام شده بر روی روغن زیتون روی خصوصیات شیمیایی و تغذیه‌ای آن بوده است، درحالیکه روی خصوصیات میکروبیولوژیکی کمتر مطالعه شده است.

با توجه به داده های علمی موجود امکان پذیر نیست تا مشخص شود چه میزان میکروارگانیزم در بهبود خصوصیات organoleptic روغن زیتون طی فرایند ته‌نشین‌شدن (decantingn)دخالت دارند.

اکثر تحقیقات وجود میکروارگانیزم ها را در محصولات فرعی فرآیند های روغن زیتون نشان داده است (مانند شیره سبزیجات چنر و .همکاران1988 ).

در حالیکه اطلاعاتی که نشان دهنده وجود میکروارگانیزم‌ها در روغن تصفیه نشده زیتون وجود ندارد.

طی فرآیند های عصاره گیری، ذرات جامد ومعلق ریز شیره سبزیجاتی که با موجودات ریز سطحی زی (epiphytic) آلوده شده، در روغن زیتون تولید شده یافت می شود.

تنها چندین میکروارگانیزم قادر به بقا و ماندگاری در عصاره سبزیجات می باشند زیرا این عصاره حاوی ترکیبات فنولی ساده و پیچیده است که با فعالیت ضد میکروبی قابل تشخیص می باشند.

هدف از این تحقیق کشف میکروارگانیزمهایی است که در مرحله ته‌نشین‌سازی روغن زیتون وجود دارند و آیا اینکه پلی فنولها می توانند روی بقا و ماندگاری این میکروارگانیزمها اثر گذارند یا خیر.

مواد و روشها روغن زیتون بررسی شده در این تحقیق، از زیتون رقم leccion و از فرآوری زیتونها در دمای پایین در یک مزرعه با کشت سنتی در مرکز ایتالیا بدست آمده است.

کل مقدار روغن زیتون که معادل 400 کیلوگرم بوده که به دو قسمت تقسیم شد.

اولین بخش در دو ظرف 100 کیلوگرمی توزیع شد، درحالیکه بخش دوم از طریق فیلترهای پنبه ای صاف شده که معمولاً در صنعت بطری کردن روغن استفاده می شود و متوسط خلل و فرج (منفذ فیلتر) Porosity آن حدود mm2/0 است.

نهایتاً مقدار روغن صاف شده در دو ظرف 100 کیلوگرمی توزیع شد.

کلیه ظرفها از فولاد زنگ نزن ساخته شدند و یک متر طول داشتند و متوسط فاصله آنها از انتها 50 سانتی متر بود که برای گرفتن نمونه ها استفاده شد.

قبل از انجام روغن‌گیری روغن زیتون، کانالها با 75 درصد الکل اتیل ضد عفونی شدند و آنگاه سه مرتبه با آب تقطیر شده استریل شست و شو داده شدند و سپس در اتاق دما خشک شدند.

روغن این لوله‌ها در دمای ثابت نگهداری شد این دما 0c15 بود.

آزمایشات طی پنج ماه انجام شدند و حدود mL300 نمونه در ابتدای آزمایش (زمان صفر) گرفته شد.

و سپس هر ماه یکبار از هر ظرف نمونه گرفته شد.

هر نمونه با پی‌پت استریل گرفته شده و به دو گروه تقسیم شد و تحت تجزیه و تحلیل از نظر میکروبیولوژی و شیمیایی قرار گرفت.

نمونه‌های جدید روغن زیتون تولید شده زیر میکروسکوپ نوری BX50 Olympus با بزرگنمایی 600× بررسی شد.

این میکروسکوپ دارای دوربین 10OM است.

تحلیل های شیمیایی روتین اسیدیته پراکسیدها و دیگر پارامترهای مواد شیمیایی در طبقه بندی تجاری روغن زیتون بر اساس مقررات اروپا انجام شد.

غلظت کلی پلی فنولهای موجود در روغن زیتون با اضافه شدن 10 میلی لیتر مقادیر از نمونه های روغن زیتون معادل با حجم عصاره مرکب از متانول و بی کربنات سدیم 5-8pH (N5/0) با نسبت 60:40 آنالیز شد.

پس از 10 دقیقه مخلوط با ورتکس، دو مرحله با قیف‌های جداگانه جدا شدند و به لوله آزمایش پیرکس Pyrex انتقال داده شدند.

پس از سه نوبت عصاره گیری، قسمتهای آب‌دار رویی حاوی پلی فنولها در یک آزمایش هم‌زمان بررسی شدند و مورد تحلیل و تجزیه قرار گرفت.

مقادیر نهایی بدست آمده به شکل اسید کافئیک بیان شدند.

تجزیه های میکروبیولوژی کل‌باکتریها براساس شمارش استاندارد روی‌آگار(Standard Plate Count agar) انجام شد و باکتریهای اسید لاکتیک در آگار MRS کشت شد.

(Oxoid).

ظروف حاوی آگار با حجم متفاوتی از نمونه های روغن زیتون اصلی و اولیه تلقیح شدند و هر صفحه حاوی 20، 50، 100، 150 و 200 مول روغن بود که از هرکدام پنج نمونه گرفته شد.

و آنگاه به مدت پنج روز در دمای 0c32 نگهداری شدند.

کپکها پس از هفت روز که در دمای 0c28 با استفاده از آگار دارای گلوکز عصاره مخمر (oxid) حاوی 1-Mgml100 جنتامایسین و کلرامفنیکل نگهداری شده بودند، مورد بررسی قرار گرفتند.

مخمرها هفت روز بعد از نگهداری در0c28 برروی محیط کشت sabouraud اندازه گیری شدند.

کل‌باکتریها براساس شمارش استاندارد روی‌آگار(Standard Plate Count agar) انجام شد و باکتریهای اسید لاکتیک در آگار MRS کشت شد.

تلقیح روغن زیتون با مخمرها آلودگی روغن زیتون با استفاده از سوش /C6 Candida wickerhamii شبیه‌سازی شد که قبلاً در آزمایشگاه جدا شده بود.

کلنی های مخمری که در سطح محیط کشت sabouraud رشد کرده بودند و در آب مقطر استریل یا در عصاره گیاهی رقیق شده که طی عصاره گیری از روغن زیتون تولید شده بودند بصورت سوسپانسیون درآمدند.

عصاره گیاهی رقیق شده که، حاوی پلی فنولها معادل با 6/0 میلی گرم اسید کافئیک در هر میلی لیتر پس از استریل شدن از طریق فیلترهای نیتروسلولزی با سوراخهای mm2/0 استفاده شد.

در هر دو نوع ظروف تلقیح شده با آب استریل یا عصاره گیاهی، میزان زیست توده مخمرها به 5/0 درصد (W/V) رسید.

دو نوع مایه تلقیح به صورت جداگانه به mL1000 روغن زیتون استریل شده به نسبت 1 درصد (V/V)استفاده شد.

از هر نوع مایه تلقیح، چهار نمونه استفاده شد و کلیه نمونه ها در دمای 0c30 به مدت 14 روز بدون به هم زدن نگهداری شدند.

طی این مدت از نمونه ها به صورت اسپتیک نمونه گیری شد و با استفاده از ورتکس توده روغنی کمی مخلوط می‌شد.

آنالیزهای میکروبیولوژیکی.

آنالیز یا به عبارتی تجزیه و تحلیل مخمرها با استفاده از روش فوق الذکر انجام شد.

اندازه گیری کل پلی فنول موجود در بخش آبی روغن.

پلی فنولهایی که از روغن زیتون به بخش آبی حرکت کرده بودند به مایه تلقیح اضافه شدند تا در زمان آغاز آزمایش و پس از هر روز دوره انکوباسیون اندازه گیری شدند.

نمونه های 95 میلی لیتر در g10000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند و5/0 میلی لیتر جزء آبی با استفاده از پی پت پاستور گرفته شد و مورد تجزیه قرار گرفت تا میزان پلی فنول‌های آن مشخص شود.

تجزیه و تحلیل‌ها با یک یا دو بخش معادل با 2/0 میلی لیتر انجام شد و به نسبتهای متفاوت با محلول N5/0 بیکربنات سدیم (5/8 PH)[ رقیق شد.

آنگاه2 میلی لیتر از هر محلول رقیق شده به لوله آزمایش پیرکس انتقال داده شد و همانطور که قبلاً گزارش شده مورد تجزیه قرار گرفت.

مقادیر بدست آمده به شکل اسید کافئیک بیان شد.

نتایج تجزیه های شیمیایی متداول طی فرآیند ته‌نشین‌سازی (decanting) انجام شد و دسته‌بندی روغن زیتون به عنوان روغن زیتون تصفیه نشده مورد بررسی قرار گرفت.

در حقیقت، برخی از خصوصیات شیمیایی مثل اسیدیته و پراکسیدها، در طی زمان کم و بیش ثابت ماند و بین 4/0 و 6/0 درصد (W/W) اسیدالوئیک و15-10 میلی گرم 2O در هر 100 گرم روغن دسته بندی شد.

با بررسیهای میکروسکوپی روغن زیتون جدیداً تولید شده، ذرات جامد بسیاری مشاهده شد و قطره های آب دارای روغن حاوی میکروارگانیزم هایی بود که طی نگهداری روغن زیتون فعال باقی مانده بودند (شکل 1) با بررسی میکروبیولوژیکی انجام شده روی روغن زیتون طی فرآیندهای ته‌نشین سازی (decanting)، وجود مخمرهایی در روغن زیتون جدیداً تولیدشده گزارش شد.

(شکل 2).

کپکها متعلق به جنس Aspergillus بودند و گاهی اوقات در نمونه ها مشاهده می شدند، درحالیکه باکتری هرگز یافت نشد.

روغن زیتون فیلتر شده جدید در مقایسه با روغن فیلتر نشده حاوی مخمر کمتری بود؛ با این وجود، طی دوره رسوب مخمرهای تولید شده در هر دو نمونه روغن به تدریج کاهش یافتند بخصوص در روغن فیلتر شده، به این صورت که به صورت کامل پس از سه ماه حذف شدند.

آنالیزهای شیمیایی روی نمونه های روغن غلظت کمتری از پلی فنولها را در روغن فیلتر شده نشان داد.

با این وجود هر دو روغن، پلی فنولها طی اولین ماه کاهش یافت، درحالیکه در ماههای بعد، تغییراتی در آنها ظاهر شد و این روند کندتر بود زیرا پس از چهار ماه نگهداری، این تغییرات ثابت شده بودند.

آزمایشات صوت گرفته روی مایه تلقیح روغن استریل، با استفاده از مخمر جداشده از همان کشت انجام شد و ثابت کرد که میکروارگانیزم‌ها در روغن زیتون زنده می مانند.

در حقیقت طی اولین روزهای دوره انکوباسیون، افزایش سریعی در تعداد مخمرها دیده شد.

با این وجود بیشترین سطح کلنی تشکیل شده در روغن زیتون با مخمرهای معلق در آب تقطیر شده استریل تلقیح شد (شکل 3).

آنالیز شیمیایی پلی فنول‌ها نشان می‌دهد که از روغن به سمت آب حرکت کرده اند و انباشتگی سریع این ترکیبات در روز چهارم، بخصوص در نوع تلقیح متشکل از مخمر و آب تقطیر شده استریل دیده شد.

در روزهای بعدی، غلظت پلی فنول یافت شده در جزء آبی دو نوع تلقیح به حد تعادل رسید.

بدون اینکه تفاوت بیشتری نشان داده شود.

بحث این تحقیق روی روغن زیتون طی مدت رسوب شدن انجام شد و نشان داد که مخمرها بیشترین جمعیت میکروبی در روغن زیتون جدیداً تولید شده هستند که در طی دوره ته‌نشین‌سازی زنده می‌مانند و دوام می‌آورند.

مخمرها در ذرات جامد قطرات ریز عصاره میوه زیتون به دام می افتادند.

در حقیقت کاهش جزئی در تعداد کل مخمرها در روغن فیلتر شده مشاهده شد که به حذف مکانیکی ذرات معلق موجود در روغن که به میکروارگانزیم‌ها آلوده شده بودند نسبت داده می شود (شکل 2).

کاهش تدریجی مخمرهای زنده در روغن طی رسوب شدن دیده می شود و می تواند به حرکت کند و آرام ذرات معلق حاوی میکروارگانیزم‌ها نسبت داده شود که با حرکت به طرف پائین لوله موجب تشکیل رسوب می‌شوند.

در حقیقت، فرایندهای رسوب کردن در روغن زیتون صاف نشده طی اولین ماه نگهداری سریعتر است.

علاوه بر این، مشاهده کاهش میزان کلی پلی فنول ها طی اولین ماه نگهداری روغن مربوط به رسوب کردن جامدات معلق در روغن زیتون است.

این فرآیند در روغن جدیداً تولید شده سریع است زیرا غنی از اجسام و ذرات درشت که حاوی پلی فنول می‌باشند بوده و سریعتر به طرف پایین لوله آزمایش حرکت می کنند (شکل 2).

فیلتر کردن باعث کاهش شدید کل پلی فنولهایی می شود که در روغن زیتون تازه تولید شده وجود دارند زیرا بخشی از ذرات معلق آن که غنی از میکروارگانیزم ها و پلی فنولها می‌باشند از آن حذف شده اند.

نتایج آزمایشات تلقیح مصنوعی روغن استریل در شکل 3 گزارش شده است.

شکل 3 نشان می دهد مخمر C.Wickerhamii می تواند در این محیط جایگاه رشد کند و رشد آن وابسته به غلظت پلی فنولهای موجود در محیط کشت آبی است.

در حقیقت بیشترین رشد مخمر، در روغن تلقیح شده با مخمری رخ می‌دهد که در آب استریل به صورت سوسپانسیون درآمده باشد و می تواند به غلظت کمتری از پلی فنولهایی نسبت داده شود که طی چهار روز اول انکوباسیون در بخش آبی دارای روغن زیتون مشاهده شده‌اند.

با بررسی فعالیت میکروبیولوژیکی روغن و حذف میکروارگانیزم ها با فیلتراسیون، امکان دارد ساختار طبیعی روغن طی مرحله رسوب کردن بدست آید و روغن زیتون تصفیه نشده با کیفیت بسیار بالا تولید شود.