دانلود تحقیق کمبودهای ایمنی مادرزادی و اکتسابی

یکپارچگی سیستم ایمنی برای دفاع بر ضد ارگانیسم های عفونی و فرآورده های سمی آن ضروری بوده و در نتیجه ضامن بقای فرد است .

بیماریهای نقص ایمنی عموماً در دو دسته طبقه بندی می گردند : 1 بیماریهای کمبود ایمنی اولیه یا مادرزادی : 1 نقص در لنفوسیت B 2 نقص‌درلنفوسیت T نقص در لنفوسیت B : 1 آگاماگلوبولینمی وابسته به x ( بروتون ) 2 کمبود انتخابی یک ایزوتایپ ایمونوگلوبولین مثلاً IgA deficiency 3 کمبود ایمنی شایع متغیر (CVID) نقص در لنفوسیت T : سندرم دی جورج 2 بیماری های کمبود ایمنی ثانویه یا اکتسابی : 1 سوءتغذیه 2 شیمی درمانی 3 ویروس نقص ایمنی HIV کریپتوسپوریدیوم برای اولین بار در سال 1907 بوسیله تایزر از غدد معدی یک موش آزمایشگاهی جدا شد .

تعریف بالینی اولین مورد درمانگاهی کریپتوسپوریدیوز گاوی بوسیله پانسیرا در سال 1971 صورت گرفت و اولین مورد آلودگی انسان توسط نایم و همکاران در سال 1976 در یک کودک سه ساله با ایمنی کامل مبتلا به آنتروکولیت حاد تشخیص داده شد .

در همان سال میسل و همکاران نیز از مردی 39 ساله مبتلا به نقص ایمنی در واشنگتن توسط بیوپسی مخاط روده مشاهده شد .

سومین مورد آلودگی در یک پسر بچه 9 ساله مبتلا به هیپوگاما گلوبولینمی مادرزادی گزارش شد .

بین سالهای 1980 و 1983 بیش از 80 مورد گاستروآنتریت با عامل کریپتوسپوریدیوم در انسان در افراد سالم از نظر سیستم ایمنی و افراد دچار نقص ایمنی به خصوص ایدز گزارش گردید .

از سال 1983 به بعد کریپتوسپوریدیوزیس در افراد با ایمنی کامل و نیز در افراد دارای نقص ایمنی و هم چنین در حیوانات مختلف در اکثر کشورهای جهان گزارش گردیده است .

تنوع گونه های کریپتوسپوریدیوم : در خانواده کریپتوسپوریدئیده تنها جنس کریپتوسپوریدیوم مشاهده می شود اما در مورد گونه های مختلف این جنس نظرات مختلفی مطرح شده است.

گونه ای که بیشتر انسان و پستانداران را آلوده میکند ، کریپتوسپوریدیوم پاروم می باشد .

به علت عدم وجود شواهد کافی درمورد اختصاصی بودن این انگل ها از نظر میزبان می توان آن ها را بعنوان یک گونه واحد در نظر گرفت .

پیوستگی گونه ها توسط لواین بررسی شد و چها گونه را مشخص کرد : کریپتوسپوریدیوم موریس در پستانداران کریپتوسپوریدیوم مله آگردیس در پرندگان کریپتوسپوریدیوم کروتالی در مارها کریپتوسپوریدیوم نازوروم در ماهی ها علاوه بر گونه های مذکور کریپتوسپوریدیوم با یله ای در پرندگان ، کریپتوسپوریدیوم رایری در خوکچه هندی ، کریپتوسپوریدیوم بویس در گاو، کریپتوسپوریدیوم فلیس در گربه ، کریپتوسپوریدیوم پاروم در انسان و اکثر پستانداران .

کریپتوسپوریدیوم : کریپتوسپوریدیوم در حال حاضر به عنوان یکی از عوامل شایع در ایجاد اسهال در انسان و حیوانات سراسر نقاط دنیا شناخته شده است .

کریپتوسپوریدیوم یک تک یاخته کوکسیدیائی است که قادر است علاوه بر اپی تلیوم دستگاه گوارش و تنفس به سایر نقاط بدن از جمله غدد ضمیمه دستگاه گوارش و برخی از قسمت های دستگاه ادراری و تناسلی دست یابد .

ضمناً وجود انگل در حلق ، نای ، معده ، دوازدهه ، کیسه صفرا ، آپاندیس ، ایلئوم ، کولون و رکتوم افراد دارای نقص ایمنی بارها گزارش داده شده است .البته به نظر می رسد که راه اصلی انتقال انگل از طریق (Fecal – oral ) باشد .

شیوع عفونت در مهد کودک ها ، مسافران ، افرادی که با حیوان سروکار دارند، در افراد هم جنس باز و کسانی که با افراد مبتلا به این انگل ارتباط دارند و همینطور افراد مبتلا به ایدز گزارش شده است .

آلودگی به این انگل را به دلایل زیرباید جدی گرفت : 1 هنوز درمان کاملاً موثری برای آن شناخته نشده است .

2 به دلیل کوچکی ومقاوم بودن اووسیست ها راه قطعی برای از بین بردن آن ها توصیه نشده است .

3 مرگ و میر ناشی از اسهال های کریپتوسپوریدیائی در مبتلایان به نقص ایمنی به خصوص ایدز در چند سال اخیر قابل توجه بوده است .

4 اهمیت اقتصادی بیماری در دامپزشکی به علت درصد بالای آلودگی در حیوانات خصوصاً در نشخوارکنندگان .

نقش ایمنی در ابتلا به کریپتوسپوریدیوم : به نظر می رسد که به هم خوردن تعادل سیستم ایمنی هومورال و یا سلولار در کریپتوسپوریدیوزیس سبب ایجاد عفونت های طولانی و خطرناک می شود .

در بیماران مبتلا به ایدز و کسانی که از داروهای تضعیف سیستم ایمنی استفاده می کنند و همینطور در افراد دچار هیپوگاما گلوبولینمی این انگل سبب عفونت جدی و طولانی مدت می شود .

پاسخ های ایمنی در برابر انگل با واسطه سلولی است و شواهد آن وجود بیماری در افراد مبتلا به ایدز می باشد که دچار نقص در این سیستم می باشند و یا مربوط به ایمنی هومورال می باشد که شواهد آن وجود بیماری به صورت حادتر در افراد مبتلا به هیپوگاما گلوبولینمی می باشد .

راههای انتقال کریپتوسپوریدیوم : اصلی ترین راه انتقال انگل به انسان و سایر حیوانات از راه خوردن اووسیست می باشد .

انتقال به دو طریق شهری و روستائی می باشد .

انتقال شهری یا مستقیم : در ابتدا تصور می شد که حیوانات منشأ عفونت برای انسان هستند .

ولی گزارشات بعدی درافراد مبتلا به انگل هیچگونه شواهدی دال بر تماس با حیوانات اهلی یا حیوانات مزرعه را نشان نمیداد و سرانجام مشخص شد که در جوامع شهری انتقال از راه فرد بیمار به فرد سالم صورت می گیرد .

آب به عنوان عامل مهمی در انتقال انگل مطرح می شود .

انتقال از راه غذا ، میوه وسبزی جات هم گزارش شده است .

انتقال روستائی یا زئونوتیک : انتقال روستائی ابتدا به عنوان عامل اصلی عفونت برای انسان مطرح بود زیرا در دو مورد بیماری در انسان تماس با حیوانات وجود داشت و ضمناً مشخص شد که دامداران دارای علائم و فاقد علائم و همچنین خانواده های آنها به میزان زیادی اووسیست های این انگل را دفع می کنند .

سیکلوسپورا : در ابتدا چنین تصور می شد که این ارگانیسم از خانواده جلبک های سبز آبی می باشد و به همین علت آن را سیانوباکتریوم نامگذاری کرده بودند ، ولی بعداً متوجه شدند که این ارگانیسم تک یاخته ای از زیر رده کوکسیدیا و از جنس سیکلوسپورا می باشد .

موارد گزارش شده آلودگی با این انگل تا سال 1979 میلادی ناچیز بوده ولی با افزایش اطلاعات و آگاهی در مورد این انگل ، شناخت اسهال های ناشی از آن از سال 1989 به بعد افزایش یافته است .

بیماری زائی : از نظر کلینیکی یک اسهال طولانی مدت در فصل تابستان و یا در کسانی که از نواحی گرمسیری باز می گردند راهنمای تشخیص خوبی برای انگل محسوب می شود .

به طور کلی علائم بالینی در سیکلوسپورا بسیار شبیه به کریپتوسپوریدیوزیس می باشد.

بیشتر مبتلایان به سیکلوسپوریازیس را مبتلایان به نقص سیستم ایمنی خصوصاً نقص ایمنی سلولی و مسافرانی شامل می شوند که به کشورهای در حال توسعه مسافرت نموده اند .

اولین مورد سیکلوسپوریازیس در ایران بوسیله دکتر رضائیان و همکاران در سال 1375 در یک بیمار مبتلا به ایدز شناسایی گردید .

ژیاردیا لامبلیا : این انگل انتشار جهانی دارد .

انتقال انگل با بلع کیست های چهار هسته ای همراه آب و مواد غذایی آلوده صورت می گیرد .

البته تماس مستقیم با افراد آلوده هم می تواند یکی از راههای مهم انتقال باشد .

ژیاردیا لامبلیا در بین کودکان شایع تر است به خصوص درکودکانی که در مدارس و پرورشگاهها به صورت دسته جمعی زندگی می کنند ، آلودگی به این انگل بسیار شایع است .

تحقیقات نشان داده که کمبود ایمونوگلوبولین IgA سبب می شود ژیاردیوز به صورت شدیدتری بروز نماید .

سیتوتوکسی سیتی برای ژیاردیا لامبلیا در سلول های فعال effector دیده شده است پس هم ایمنی هومورال و هم سلولار در محدود کردن عفونت نقش مهمی ایفا می کنند .

ایزوسپورابلی: این انگل یک تک یاخته کوکسیدیائی از شاخه آپی کمپلکسا و از جنس ایزوسپورا می باشد که درافراد مبتلا به نواقص سیستم ایمنی سبب ایجاد اسهال های طولانی مدت می شود .

این انگل درافراد سالم از نظر سیستم ایمنی یک گاستروآنتریت ملایم ایجاد می کند.

در آمریکا ایزوسپورا بلی به عنوان یک عفونت فرصت طلب در مردان هم جنس بازی که مبتلا به سندرم نقص ایمنی هم بودند به کرات دیده شده است .

بیماری در هائیتی و آفریقا هم در افراد مبتلا به ایدز گزارش شده است .

اسهال مزمن و عود کننده در بیماران مبتلا به لوسمی که داروهای سرکوب کننده ایمنی مصرف می کردند دیده شده است .

ایزوسپوریازیس به صورت تک گیر درتمام دنیا دیده شده و بیشتر در نواحی گرمسیری و نیمه گرمسیری شایع است .

موارد تک گیر عفونت از همه جای دنیا مثل مصر ، عراق ، ایتالیا ، فلسطین، ترکیه ، مراکش ، جنوب سودان ، آفریقا ، هند ، چین ، ژاپن و اندونزی و ….

گزارش شده است .

بلاستوسیستیس هومینیس : برای اولین بار بوسیلهbrumpt در سال 1912 معرفی شد و مشابه بلاستومیسس ها جزء مخمرهای قارچی بی آزار روده انسان معرفی شد .

سپس zierdt در سال 1960 بلاستوسیستیس را در نمونه های مدفوع اسهالی تعداد قابل توجهی از افراد مبتلا به آنتریت حاد که بعضی از آنها دچار نقص در سیستم ایمنی بودند تشخیص داد .

این انگل بارها درافراد مبتلا به HIV دیده شده است .

استرونژیلوئیدس استرکورالیس : این کرم را برای اولین بار در مدفوع سربازان فرانسوی که از اندونزی مراجعت کرده بودند و مبتلا به اسهال بودند پیدا کردند .

این انگل در تمام دنیا مشاهده شده است .

اما چون مرحله آزاد آن در گرما بهتر زندگی می کند آلودگی در کشورهای گرمسیر بیشتر است .

در بسیاری از مناطق آلودگی به این انگل همراه با کرم قلابدار دیده شده است .

در ایران در مناطق ساحلی شمال میزان آلودگی بیشتر از سایر نقاط کشور می باشد.

پس از مستقر شدن کامل کرم ها در روده ، اختلالات گوارشی ، درد شکم، اسهال ، استفراغ ، نفخ ، یبوست دیده می شود .

در اطفال ، مبتلایان به نقص سیستم ایمنی ، مصرف کنندگان داروهای سرکوبگر ایمنی مانند کورتیکواستروئید ها ، همودیالیزی ها ، معتادین و الکلی ها عوارض بسیار شدیدتر است و بسیاری از اعضای خارج روده ای حتی سیستم اعصاب مرکزی را هم فرا می گیرد .

در این نوع بیماران ، به علت آلودگی شدید و اشاعه باکتری ها در بدن مرگ ممکن است ایجاد شود که علت اصلی آن پنومونی همراه با آنتروکولیت حاد است .

لازم به ذکر است افرادی که باید تحت درمان با داروهای سرکوبگر ایمنی قرار بگیرند باید قبلاً از نظر استرونژیلوئیدس آزمایش شوند و مطمئن باشند که فاقد آلودگی از این نظر هستند .

در غیر این صورت مصرف داروهای یاد شده سبب افزایش حساسیت میزبان به این انگل می شوند .

میکروسپوریدا : میکروسپوریداها ، گروهی از عوامل فرصت طلب هستند که به طور اجباری زندگی درون سلولی داشته ، و آنها را جزء تک یاخته گان روده ای طبقه بندی می کنند .

هنوز چرخه اصلی زندگی آنها شناخته نشده است و نمی توان آن ها را به درستی طبقه بندی نمود .

آنها را حد واسط بین یوکاریوت ها و پروکاریوت ها می دانند .

میکروسپوریداها پنج جنس مختلف دارند که قادر به ایجاد عفونت در انسان می باشند .

این جنس ها عبارتند از : انسفالیتوزون ، پلیستوفورا ، نوزما ، میکروسپوریدیوم ، انتروسیتوزون ( انسفالیتوزون(septata intestinalis) گروه دیگری از محققان پنج جنس میکروسپوریدا را در انسان پاتوژن می‌دانند که شامل : آنسفالیتوزون ، پلیستوفورا ، نوزما ، سپتاتا ، انتروسیتوزون .

بعضی از محققان راسته میکروسپوریداها را به دو تحت راسته تقسیم نموده اند .

pansporoblastina در سلول میزبان اسپوروله شده ، و در داخل یک اسپروسیست احاطه می گردند ( بوسیله غشا پان اسپروبلاستیک ) (pleistophora) Apansporoblastina : که فاقد غشا پان اسپروبلاستیک بوده و در داخل سلول میزبان آزاد هستند .(Encephalitozoon , Nosema ) مشخص نشده دو جنس میکروسپوریدرم و انتروسیتوزون در کدام یک از دو تحت راسته طبقه بندی می گردند .

میکروسپوریدا انتشار جهانی دارند و اگر در نقاطی تا کنون گزارش نشده است ، تصور می شود که عمدتاً به علت ضعف در تشخیص آزمایشگاهی بوده است .

به جز انتروسیتوزون که خاص انسان است ، بقیه جنس های میکروسپوریداها قادرند بسیاری از حیوانات مهره دار و بی مهره را گرفتار کنند .

( گونه نوزوما ـــ کرم ابریشم ) ، ( پلیستوفورا ـــــ ماهی و حشرات ) هرچند میکروسپوریداها قادرند در افراد سالم نیز عفونت های خود محدود و بدون علائم بالینی ایجاد کنند ، ولی در افراد دچار نقص سیستم ایمنی سلولی خصوصاً ایدز ایجاد بیماری با علائم بالینی فراوان می کنند .

یکی از ویژگی های میکروسپوریداها قابلیت انتشار در بدن میزبانان می باشد .

مثلاً گزارشاتی در مورد ایجاد هپاتیت و پریتونیت بوسیله گونه انسفالیتوزون ، میوزیت بوسیله گونه پلیستوفورا ، کراتیت بوسیله گونه نوزوما و میکروسپوریدیوم در بیماران مستعد وجود دارد .

در یک گزارش نوزوما کونوری ( در یک کودک مبتلا به نقص ایمنی پس از ایجاد کراتیت منتشر شده به معده ، روده ، قلب ، کبد ، ریه حمله نموده است .) ازبین جنس های فوق انتروسیتوزون مخصوص انسان است و اسهال های مزمن و مقاوم به درمان در مبتلایان به ایدز ایجاد می نماید .

شروع عفونت با بلع اسپورها آغاز می شود .

اسپورها از سد شیره معده عبور می کنند و خود را به دوازدهه می رسانند و اسپوروپلاسم حاوی هسته خود را به داخل سلولهای اپی تلیال تلقیح می کنند .

در صورت ورود به داخل سلول مناسب ، ( چه در داخل واکوئل پارازیتوفوروس و چه آزادانه) تکثیر می کنند .

روش تکثیر آن ها به صورت تقسیم دوتایی ساده است که به آن مروگنی می گویند .

سپس مرحله اسپوروگنی شروع می شودو اسپورها ایجاد می شوند .

تکثیر ارگانیسم سبب تخریب شدن ومرگ سلول میزبان می شود و پس از خروج ارگانیسم ، با حمله به سلولهای مجاور موجب ایجاد ضایعات بافتی می گردد .

اسپورهای دفع شده از راه مدفوع و ادرار قادر است عفونت را در جامعه منتشر کند.

هرچند منشا اصلی عفونت انسانی هنوز شناخته نشده است ولی راه (Fecal-oral) اصلی ترین راه انتقال آن می باشد .

علائم بالینی : بسته به ارگان مبتلا ، متغیر است .

دستگاه گوارش و خصوصاً روده باریک اولین و شایعترین ارگان مبتلا می باشد .( زیرا تکثیر اولیه میکروسپوریداهای بیماری زا ابتدا در داخل روده باریک انجام می شود و سپس در صورت وجود نقص ایمنی این عوامل از طریق لنف و خون خود را به ارگان های دیگر بدن می رسانند و ایجاد عفونت می کنند .

میکروسپوریدا باعث تخریب میکروویلی های دوازدهه شده ودر نتیجه سبب کاهش سطح جذب می شوند .

بیمار سابقه ای از اسهال های طولانی و مزمن را ذکر می کندکه به داروهای رایج پاسخ نداده است .

درگیری مجاری صفراوی ، کلیه ، چشم هم گزارش شده است .

تشخیص آزمایشگاهی : از آن جایی که احتمال درگیری هر ارگانی در میکروسپوریدیوزیس وجود دارد نمونه های ارسالی به آزمایشگاه هم متنوع بوده و این ارگانیسم را می توان از نمونه های بافتی ، ترشحات دئودنوم ، ادرار ، مدفوع ،خلط ، ترشحات حلق و بینی ، مایع نخاع ، ترشحات ملتحمه ، شیره پانکراس جدا نمود.

اندازه اسپورها 4ـ1 میکرون است .

هر چند در رنگ آمیزی گرم ، متغیر رنگ می گیرند ولی اکثراً گرم مثبت هستند .

در رنگ آمیزی اسید فست صورتی مایل به قرمز دیده می شوند .

ضمناً از روش های رنگ آمیزی گیمسا ،PAS و کروموتروپ هم می توان برای تشخیص آن استفاده نمود .

در روش کروموتروپ مشاهده سه اسپور که شکل تیپیک داشته باشند جهت تشخیص کافی است .

در صورت در دست بودن آنتی بادی های اختصاصی می توان جهت تشخیص آنها درنمونه ها از تکنیک ایمونوفلورسنت استفاده کرد .

میکروسکوپ الکترونی روش تشخیصی دیگری است ولی برای تشخیص اولیه آن ها ضروری نمی باشد .

از آن جایی که این عوامل رشد درون سلولی دارند ، کشت آن ها تنها در محیط های سلولی امکان پذیر است معمولاً در این محیط ها از سلول های ریه جنین انسان استفاده می گردد زیرا دراین محیط ها میکروسپوریدا در عرض 28 روز ایجاد اثرات سیتوپاتیک می کند .

این اثرات به صورت کانون هایی از سلولهای کروی شده مشاهده می شوند که در صورت تهیه لام و رنگ آمیزی از آنها ارگانیسم درون سلولی دیده می شود .

از جمله تکنیک های دیگر ، آنالیز پروتئین های دیواره ای به کمک SDS – page ، وسترن بلات ، وPCR می باشد .

ولی آسانترین راه تشخیص مخصوصاً در روده باریک گرفتن لاواژ دوازدهه ، تهیه گسترش و رنگ آمیزی با گیمسا ، گرم ، کروموتروپ و مشاهده اسپور می باشد .

عوامل مورد بررسی : از آن جایی که هدف این بررسی تشخیص عفونت های انگلی در افراد مبتلا به نقص سیستم ایمنی که شامل ( کریپتوسپوریدیوم ، ایزوسپورا ، میکروسپوریدا ، استرنژیلوئیدس استرکورالیس ) می باشند بود در این بررسی سعی گردید که نمونه ها از این نظر بررسی گردند .

البته یافتن تک یاخته های دیگر که شامل ژیاردیا لامبلیا ، بلاستوسیستیس هومینیس ، کیلوماستیکس مسنیلی ) بودند جزو اهداف فرعی این پایان نامه بود .

ابتدا از نمونه های مدفوع لام مستقیم تهیه شده و با لوگل رنگ آمیزی موقت می شوند ، همینطور تغلیظ به روش فرمالین اتر و سپس تهیه گسترش های مرطوب ، تغلیظ به روش فلوتاسیون با شیتر تهیه گسترش های رنگ آمیزی شده با اسیدفست ، کروموتروپ اختصاصی ، کالکافلور وایت نیز استفاده گردید .

1ـ تهیه گسترش مرطوب با لوگل: مقدار کمی از stool را بر روی لام قرار داده و سپس با یک قطره لوگل به صورت سوسپانسیون یکنواختی در می آوریم و با درشت نمایی 10 و40 بررسی شد .

در این بررسی هدف تشخیص گلبولهای قرمز و سفید احتمالی و مشاهده احتمالی انگل هایی بود که به تعداد زیاد وجود دارند .

در این روش مخمرها و شبه مخمرها هم تشخیص داده شدند .

تغلیظ به روش شیتر: در این روش که مخصوص انگل هایی مانند کریپتوسپوریدیوم ، سیکلوسپورا و ایزوسپورا صورت گرفت .

10 گرم مدفوع در آب شکر اشباع شده حل کرده و سوسپانسیون یکنواختی تهیه می شد و سپس لوله را در جا لوله ای به صورت ثابت قرار داده و روی آن محلول شیتر تا قسمت فوقانی لوله اضافه می شد و سپس روی آن یک لامل قرار داده و به مدت 20 دقیقه بدون حرکت در جای خود قرار می دادیم و سپس لامل را برداشته بر روی یک لام گذاشته و در زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار می دادیم .

طرز تهیه محلول شیتر : شکر 500 گرم آب مقطر cc 320 فنل gr 5/ 6 فنل جهت حذف عوامل قارچی و برای نگهداری محلول شیتر به مدت طولانی تر می باشد.

سپس محلول تهیه شده را مدتی روی هیتر قرار می دادیم تا شکر کاملاً حل شود ، پس از آن فنل را به آن افزوده و در ارلن را با پارافیلم بسته ودر یخچال نگهداری می کنیم .

روش دوم فلوتاسیون با ساکارز : ابتدا تا نصف لوله محلول شیتر می ریزیم .

سپس 10 گرم مدفوع قوام دار به محلول فوق اضافه می شود به کمک اپلیکاتور محلول مخلوط می گردد و از محلول شیتر به لوله اضافه می شود تا سطح محلول به چند میلی متری سطح دهانه لوله برسد .

لوله را با دور RPM 3000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ می کنیم و بدون هیچ دخالتی اجازه می دهیم سانتریفوژ بایستد .

با استفاده از لوپ در حالی که لوله در داخل سانتریفوژ است از سطح محلول برداشت کرده و روی لام می گذاریم سپس لامل گذاشته و بررسی می کنیم .

باید هنگام برداشت نمونه دقت کنیم لوپ فقط با سطح محلول تماس پیدا کند این روش جهت تشخیص کریپتوسپوریدیوم و سایر کوکسیدیاها مناسب به نظر می رسد ولی برای تشخیص سایر تک یاخته های روده ای مناسب نمی باشد .

پس از آزمایش روش اول و دوم ، روش دوم به علت صرف زمان کمتر استفاده گردید .

تهیه گسترش رنگ شده : ـ از رسوب فرمالین اتر گسترش های نازکی برای رنگ آمیزی تهیه گردید.

هدف از این کار مشاهده اووسیت های ایزوسپورا ، کریپتوسپوریدیوم ، سیکلوسپورا و نیز میکروسپوریدا بود .

پس از تهیه گسترش و خشک شدن بوسیله هوا روی گسترش متانول ریخته و صبر می کردیم تا خشک شود و سپس رنگ آمیزی می کردیم .

ـ رنگ آمیزی اسید فاست یا زیل نلسون گرم هدف مشاهده انگل هایی مانند ایزوسپورا ، کریپتوسپوریدیوم ، سیکلوسپورا و میکروسپوریدا بود .

در این بررسی بر روی اسمیر مدفوع یک کاغذ صافی قرار داده و سپس روی آن رنگ فوشین ریختیم و سپس لام را روی چراغ الکلی قرار می داده تا حرارت از روی لام بلند شود سپس کاغذ صافی را برداشته و لام را زیر شیر آب شستشو می دادیم و سپس لام را در اسید الکل دو درصد قرار داده( 35 ثانیه تا 1 دقیقه )، سپس لام ها را خارج کرده و با آب شستشو می دادیم .

سپس لام ها را 30 ثانیه تا حداکثر 1 دقیقه در محلول متیلن بلو قرار می دادیم سپس گسترش ها را شسته و با عدسی 100 بررسی می کردیم .

ـ رنگ آمیزی کرموتروپ اختصاصی : در این بررسی از روش weber استفاده گردید .

این رنگ آمیزی صرفاً جهت تشخیص میکروسپوریدا بود .

پس از تهیه اسمیر مدفوع که بسیار نازک تهیه شد و سپس در مجاورت هوا خشک شد روی آنها متانول ریخته و پس از خشک شدن در محلول رنگی کروموتروپ به مدت 90 دقیقه قرار می دادیم .

سپس لام ها را به مدت 10 ثانیه در محلول اسید الکل قرار می دادیم .

سپس مرحله آبگیری بود که لام ها را در الکل 95 درجه و 100 درجه قرار می دادیم و مدت زمان قرارگرفتن درالکل 95 درجه و 100 به ترتیب 5 دقیقه و 10 دقیقه بود .

سپس لام ها را در گزیلل قرار می دادیم .( به مدت 10 دقیقه ) در خاتمه کار لام ها را بوسیله کانادوبالزام مونته می کردیم .

در این روش رنگ آمیزی انگل میکروسپوریدا قرمز رنگ می شود و باکتری ها سبز رنگ دیده می شوند .

طرز تهیه محلول رنگی کروموتروپ ( روش وبر) کروموتروپ R 2 6 گرم فاست گرین 15/0 گرم اسید فسفوتنگستیک 7/0 گرم اسید استیک گلاسیال cc 3 آب مقطر cc 100 روش تهیه رنگ کروموتروپ : پس از ریختن cc 3 اسید استیک بر روی موادی که ذکر شد فلاسک حاوی آنها را به مدت 5/0 ساعت دردمای اتاق قرارداده و سپس cc 100آب مقطر را به آنها اضافه می کنیم و سپس با حرکت دادن رنگ را در آب مقطر حل می کنیم .

روش رنگ آمیزی سفید کالکوفلور : روش اول : مواد لازم : 1) تهیه محلول 5/0 درصد سفیدکالکافلور M2R دربافرتریس با 2/7 =PH 2) اوانس بلو 1/0 درصد در بافرتریس روش رنگ آمیزی : یک قطره نمونه روی لام قرار داده و یک قطره کالکافلور و یک قطره اوانس بلو اضافه می کنیم سپس لامل قرارداده و یک دقیقه در دمای اتاق قرارداده و بلافاصله مورد بررسی قرار می گیرد .

روش دوم : در این روش دو محلول ذخیره داریم که عبارتند از : محلول ذخیره الف : سفید کالکافلور سیگما 1گرم آب مقطر cc 100 محلول ذخیره ب: اوانس بلو 05/0 گرم آب مقطر cc 100 محلول کار : cc 1 از محلول ذخیره الف + cc 9 محلول ذخیره ب روش کار : نمونه را روی لام قرار داده و یک قطره از محلول کار بر روی آن قرار داده می شود .

سپس لام را به مدت 2ـ1 دقیقه در دمای اتاق قرار می دهیم تا رنگ شود .

سپس لامل قرار داده و زیر میکروسکوپ فلورسانس مورد بررسی قرار می گیرد .

روش سوم : سفید کالکافلور gr 1/0 اوانس بلو gr 05/0 آب cc 100 این مواد را کاملاً مخلوط کرده و در بطری قهوه ای و در دمای اتاق به مدت یک سال قابل نگهداری است .

روش کار : روی لام یک قطره از نمونه را قرارداده و یک قطره رنگ سفید کالکافلور تهیه شده در بالا به آن اضافه شده و سپس یک قطره KOH ده درصد روی نمونه مورد آزمایش قرارداده شده و لامل گذاشته و لام ها را به مدت 2ـ1 دقیقه دردمای اتاق قرار می دهیم تا رنگ آمیزی شود .

سپس لام ها را با میکروسکوپ فلورسانس بررسی می کنیم .

روش چهارم : رنگ کالکافلور به صورت 5/0 درصد در بافرتریس با PH:7.2 تهیه می شود و در ظرف تیره و دردمای اتاق تا یک سال قابل نگهداری است .

اسمیرها با متانول فیکس می شوند .

پس از خشک شدن لام در معرض هوا ، یک تا دو قطره محلول کالکافلور به آن اضافه می شود پس از 2ـ3 دقیقه لام ها را چند بار در آب غوطه ور می کنیم و سپس لام ها را در اوانس بلو 1/0 درصد در TBS به مدت 1 دقیقه غوطه ور می کنیم .

سپس لام ها را در آب غوطه ور می کنیم سپس لام ها را خارج می کنیم پس از خشک شدن در مجاورت هوا با چسب کانادو بالزام سیل می کنیم .

این لام با میکروسکوپ UV و فیلتری با طول موج nm 415 ـ 395 قابل مشاهده است .

در صورت مثبت بودن میکروسپوریدا به شکل بیضی یا تخم مرغی و آبی مایل به سفید مشاهده می شود در حالی که سلولهای مخمری گرد هستند و اغلب جوانه دارند و یا قطره اشکی می باشند .