دانلود تحقیق قارچ کشی شیمیایی

ایزولاسیون و فعالیت ضد قارچی وضد اومیستی آنراژین (Aerugine) تولید شده توسط pseudomonas fluorescems نوع MM-B16 باکتری MM-B16 که فعالیت شدید ضد قارچی وضد اومسیت (oomycete) را در برابر تعدادی از پاتوژن های گیاهی نشان می داد.از خاک کوهستانی کره ایزوله (جدا ) گردیده بود.

بر اساس ویژگی های فیزیولوژیکی وبیوشیمیایی و آنالیز توالی DNA در ریبوزوم 165 مشخص شد که باکتری نوع MM-B16 مشابه [pseudomonas fluorescens] می باشد.

با استفاده از روشهای مختلف کروماتوگرافی وفیلتر کردن محیط کشت p.fluorescens از نوع MM-B16 دردرون وبیرون بدن موجود زنده یک آنتی بیوتیک فعال در برابر colletotrichum orbiculara و phytophthora capsici بدست آمد.

این چنین استنتاج شد که فرمول مولکولی این آنتی بیوتیک باشد این فرمول با استفاده از آنالیز بر اساس میدان مغناتیسی هسته رزونانس و داده های حاصله از طیف مادون قرمز ثابت می شود که آنتی بیوتیک یک ساختمان مشتق شده از دیازولین (thiazolin) ، آروژین (aurugine)را دارا می باشد.

[4- هیدروکسی متیل-2-(2- هیدروکسی فنیل)-2- دیازولین].

p.capsici و c.orbiculate و pythium ultimum نسبت به آروژین بیشتر حساس بودند.

(MIC این ارگانیسم ها تقریباً ) بود.

با این حال از این ماده هیچ فعالیت ضد میکروبی بر علیه مخمرها وباکتری ها تا قبل از رسیدن به غلظت مشاهده نشده است.

استفاده از آروژین باعث جلوگیری از فعالیت وتوسعه بیماری phytophtora بر روی فلفل و anthracnose (آندراکنوز) بر روی خیار می گردد.

به هر حال خاصیت کنترل آروژین در مقابل بیماریها در کمتر از قارچ کشهای تجاری نظیر متالاکسین (metalaxyl)و کلروتالونیل (chlorothalonil) می باشد.این مطلب اولین مطالعه بر روی جدا سازی آروژین از p.

fluorescens و شرح خاصیت ضد قارچی آن ونیز فعالیتهای ضد اومسیت آن بر علیه c.orbiculare و p.

capsici در درون وبیرون موجود زنده می باشد مقدمه: قارچ کشهای شیمیایی نه تنها اتمسفر را آلوده می سازند ، بلکه در اثر تجمع این مواد شیمیایی در خاک از لحاظ محیط زیست هم مشکلی ایجاد می گردد.

تکرار استفاده از چنین مواد شیمیایی موجب تشویق موجودات هدف به ساخت مواد شیمیایی مقاوم می گردد وبا این وجود استفاده از قارچ کش ها در ---- موجب ایجاد مشکلات ومسائل خاصی گردیده است.در آینده ی نزدیک استفاده وکاربرد علف کش ها در کشاورزی افزایش خواهد یافت که در آن هنگام قارچ کش های --- و سازگارتر با اکولوژی در دسترس خواهد بود.امروزه ما نیاز زیادی به استفاده از قارچ کش هایی داریم که بتوانند عملاً در مزرعه مورد استفاده قرار گرفته و قدرت خوبی برای مقابله با پاتوژنهای یک واریته ی خاص گیاهی داشته باشند ودر عین حال بتوانند نه تنها برای انسان ها ، حیوانات وگیاهان میزبان ، بلکه برای اکوسیستم ها هم ایمن باشند.این مسئله مربوط به نیاز شدید استفاده از قارچ کش انتخابی می باشد که در طبیعت قابلیت تجزیه ی بالایی داشته باشند.

به قارچ کشهایی که منشاء میکروبی دارند و از راههای بیولوژیکی تولید شده اند ، بر روی ارگانیسم هدف ، اثر اختصاصی ندارند اما ذاتا به گونه ای هستند که ثابت شده است.

در محیط تجزیه می گردند.تولیدات میکروبی دارای ساختار شیمیایی بسیار پیچیده ای هستند به طوریکه یک ترکیب ممکن است جمعاً دو یا چند moieties شیمیایی مختلف داشته باشد که میتواند با پذیرنده های مختلفی واکنش دهد.

پیچیدگی ساختارهای آنها ممکن است موجب گردد که فرآورده های طبیعی ، گوناگونی های زیادی از لحاظ شیمیایی و بیولوژیکی داشته باشند.در هر حال استفاده از تولیدات میکروبی به عنوان قارچ کش دارای محدودیتهایی می باشد.

به عنوان مثال یکی از جنبه های زیان آور این مسئله ، احتمال ظهور مقاومت در پاتوژن های گیاهی است و باعث می شود که این پاتوژنها مکانیسم فعالیت قوی تری از خود بروز دهند.

در خلال اولین موفقیت در زمینه استفاده از streptomycin برای کنترل فایربلایت (fire blight) گلابی توسط Erwiniua amylovora که در ایالت متحده آمریکا حاصل شد.

برای یافتن تولیدات میکروبی قابل دسترس برای کنترل بیماری های گیاهی تلاشهای زیادی صورت گرفت سرانجام ماده ای به نام بلاستی سایدین s (blasti cidins) در ژاپن کشف شد که در مقابل بیماری بلاست برنج فعال بود.

در میان انواع مختلف آنتی بیوتیکهای که از متابولیتهای میکروبی حاصل گردید ، تعدادی از آنها برای کنترل بیماری های قارچی در گیاهان استفاده عملی داشتند.

برای مثال kasugamycin ، polyoxins و validamycina و mildiomycin برای کنترل بلاست برنج ، زنگرغلاف برنج و خصوصاً زنگ پودری رز استفاده تجاری داشته اند.اخیراً فعالیتهای قارچ کشی خارجی قدرتمندی از متابولیت های میکروبی کشف شده است.

در مواردی نظیر Gopalamicin ، Tubercidin ، یک نوع آنتی بیوتیک manumycin،ologomycin A،streptimidon،dounomycin،rhamnolipidB وphenylacetic-Acid (فنیل استیک اسید) فعالیت شدید ضد قارچی یا ضد اوومیستی مشاهده گردید که می توان از آنها برای کنترل بیماری های گیاهی مهمی که از لحاظ اقتتصادی فنیل استیک اسید زیان آور هستند استفاده نمود.همچنین در تعدادی از pseudomonad ها مشاهده گردید که آنها رقیب خوبی برای پاتوژنهای قارچی گیاهان بوده و در عین حال آنتی بیوتیک هم تولید نمی کنند که احتمالاً این مسئله موجر به فراوانی گروههای مختلف این نوع باکتری و اهمیت آشکار آنها در خاک گردیده است.

به طوریکه تنها یک نوع pseudomonas می تواند چندین نوع مختلف آنتی بیوتیک تولید کند.

چنین طیف وسیعی از تولید آنتی بیوتیکها می تواند در انواع مختلف دیگر نیز دیده شود به طور مثال در باکتری نوع Pf-5 pseudomonas fluorescens دیده شده است که می تواند آنتی بیوتیک های مختلفی نظیر 2و4-دی استیل فلوروگلوسینول ، pyoluteorin وسیانید هیدروژن را تولید نماید .

p.fluorescens نوع CHAO نیز دارای توانایی تولید pyrrolnitrin ، pyoluteorin و 2و4 دی استیل فلورو گلوسینول می باشد.

آنتی بیوتیک های ضد قارچ تولید شده توسط pseudomomas spp.

شاملPyrrolnitrin phenazines ، pyoluteorins 2و4-دی استیل فلورو گلوسینول ، rhamnolipids ، oomycin A ، cepaciamind A و ecomycins می باشد.

تولیدات pseudomonad به ویژه Pyrrolnitrin در ساخت ترکیبات قارچ کش جدیدی نظیر fenpiclonil و fludioxonil کاربردهای زیادی دارد.آنتی بیوتیک های ضد باکتری شامل pseudomonic Acid ، azomycin و آنتی بیوتیکهای ضد تومور FR901463 و cepafungins و آنتی بیوتیک ها ی ضد ویروسkaralioin نیز از pseudomonas -spp گرفته شده اند.

در مطالعه وتحقیقی که پیش رودارید ، ما باکتری های MM-B16 را از خاک جنگلهای کوهستانی کره خارج نمودیم که این باکتری ها رقیب پاتوژنهای قارچی گیاهی و او,مستیها می باشند.

این باکتری (MM-B16) فعالیت ضد قارچی و ضد اووفیسیتی خوبی در برابر colletotrichum orbiculare , phytophathora capsici نشان داد.

با توجه به این مطالب احتمال احتمال می رود که این باکتری fluorescens باشد.

با استفاده از فرآیندهای خالص سازی مختلف یکآنتی بیوتیک از محیط کشت باکتری p.fluorescens نوع MM-B16 بدست آمد.با انجام آنالیزهای اسپکتروسکوپی وفیزیک وشیمیایی ساختار شیمیایی این آنتی بیوتیک تعیین گردد و مشخص شد که این آنتی بیوتیک aerugine می باشد.فعالیتهای ضد قارچی و ضد اوومیسیتی aeurogine بر علیه تعدادی از بیماری های گیاهی در درون و بیرون موجود زنده و بررسی گردید.جداسازی یکی از مشتقات thiazoline یعنی aeurogine از p.fluorescens که فعالیت ضد قارچی وضد اوومیسیتی هم داشته باشد اولین بار در این مطالعه ی حاضر گزارش گردیده است.

مواد و روشها جدا سازی آنتی بیوتیک تولید شده توسط باکتری نوع MM-B16 باکتری نوع MM-B16 خاصیت ضد قارچی و اوومیتی خوبی را در سطح خارجی موجود الوده به تعدادی پاتوژنهای گیاهی نظیر alternaria mali gloeosporioides colletotrichum f.sp.cucumerinume oxysporum fusarium ، grisea magnaporthe p.

capsici Rhizoctonia solani, دارا می باشد.این باکتری از خاک کوه جنگلی chun-an و manjul کشور کره بدست آمد.

MM-B16 برای شناسایی وتولید مواد انتی بیوتیک ضد قارچ و ضد اوومیست انتخاب گردید.

MM-B16 درآگار حاوی مواد غذایی در دمای درجه سانتی گراد کشت داده شد.

بعد از محافظت طولانی مدت ، MM-B16 در آبگوشت محتوی 15 درصد گلیسرول در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شد.

تشخیص باکتری نوع MM-B16 با استفاده از روشهایی نظیر lanyi ، palleroni ، smibert و krieg ویژگی های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی باکتری آنناگرفیست (رقیب) نوع MM-B16 مورد ازمایش قرار گرفتند.شکل مورفولوژیکی MM-B16 از نظر شکل ، اندازه یا نوع flagella مورد بررسی قرا ر گرفت.

در این بررسی نمونه هایی از سلولهای باکتریایی که در محیط کشت آگار tryptic soy 24 ساعت در دمای 28 درجه رشد داده شده بودند در زیر میکروسکوپ الکترونی آزمایش و مشاهده گردیدند.

سلولهای MM-B16 با استفاده از اسیدفسفاتانسنیک (phosphotungstic acid) 1% رنگ آمیزی شدند و بعد از خشک شدن در معرض جریان هوا ، مورد آزمایش قرار گرفتند.در شناسایی MM-B16 از سیستم زنده هم برای تشخیص این نوع باکتری استفاده شدند و بعد از خشک شدن در معرض جریان هوا ، مورد آزمایش قرار گرفتند.در شناسایی MM-B16 از سیستم زنده هم برای تشخیص این نوع باکتری استفاده شد به طوریکه با انجام برش طولی در MM-B16 95 تفاوت در منبع کربنی این باکتری مشاهده گردید.

برای تشخیص توالی DNA ریبوزومی (rDNA) 165 ، DNA کروموزومی MM-B16 با استفاده از روش pospiech و Neumann استخراج گردید .ژنهای 16rRNA با استفاده از PCR گسترش داده شدند.همه پریمرهای عبارتند از: () و پریمرهای عبارتند از : .

آخرین مرحله وسیکل با استفاده از سیستم GeneAmp PCR صورت گرفت (مدل 2400 ؛ Elmer - perkin).

آخرین پروفیل استفاده شده شامل 35 سیکل بود .

از جمله یک دقیقه تقلیب سازی در دمای یک دقیقه سرد کردن در دمای ، دو دقیقه برای توسعه در دمای ، 2 دقیقه برای توسعه در دمای آخرین مرحله توسعه در دمای 8 دقیقه به طول انجامید و بااستفاده ازروش 165 rDNA ,wuetal توسعه یافته از ژل آگاروز تصفیه گردید.

سرانجام rDNA تصفیه شده به وکتور pCR2.1_TOPO متصل گردید (Invitrogen co.

,Carlsbad , calif) .این کار مطابق دستورالعمل کارخانه صورت گرفت.پس پلاسمیر حاصله به سلول Escherichia coli TOP 10 منتقل گردید.(Invitrogen co) .این کار توسط الکتروپوریشن صورت گرفت ودر آخر با استفاده از روش غربالگری آبی – سفید نمونه های تغییر شکل یافته انتخاب گردیدند.

پلاسمیدهای حاوی165rDNAبااستفاده ازسیستمwizard plus SV Minipreps استخراج میگردیدند.( promega co., , .) ژنهای RNA از روی توالی AB1310 مولکول DNA رونویسی شده اند (با استفاده از موجودات زنده ).

و در مرحله پایانی رونویسی رنگ آمیزی صورت پذیرفت.

(DE سیستم های زنده به کار رفتند ، Foster city ، calif) توالی 165 rDNA که در باکتری MM-B16 موجود است.

با توالی بدست آمده از بانک ژنی ردیف شده است (مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی ،Bethesda ، MD) .این کار با استفاده از روش clustal صورت پذیرفت (DNA STAR Inc., Madison , ) بر اسا س درصد تفاوتها در میان نژادهایک نوع تقسیم بندی (فیلوژنیک) ترتیب داده شد.

تولید و جداسازی آنتی بیوتیک در آبگوشت محتوی مواد غذایی نگهداری می کنیم.سپس آن را به ml 1500 از king medium B منتقل می کنیم (30 گرم) گلیسرول10 گرم پرونئوزپتپون 5/0 گرم و Mgso4 ،یک لیتر آب[ph 7.6] این حالت برا ی تولید ماده ی آنتی بیوتیک بهترین حالت می باشد.

این تخمیر به مدت 6 روز در دمای به یک شیگر چرخشی با rpm 150 منتقل می شود.