دانلود تحقیق اندازه گیری میزان جهش زایی علف کش ها در آزمون لکه های بال مگس سرکه

خلاصه در بخش حاضر علف کش های بنتازون (bentazone)، مولینات (molinate)، تیوبنکارب (thiobencarb) و تری فلورالین (trifluralin)، در مورد اثر جهش زایی و نوترکیبی زایی بررسی شده اند.

این بررسی به وسیله‌ی آزمون لکه های بال در دروزوفیل (آزمون جهش و نوترکیبی سوماتیک SMART) انجام شده است.

دو نوع آمیزش استاندارد (ST) و زیست فعالی زیاد (HB) استفاده شده است.

آمیزش دوم با حساسیت زیاد به پیش جهش زاها و پیش سرطان زاها، شناخته می شود.

لاروهای سه روزه، ترانس هتروزیگوت برای ژن های موهای چندتایی بال (mwh) و پهن شدگی-3 (flr3)، با شش غلظت متفاوت از هر نوع علف کش تغذیه شدند.

تغذیه تا تبدیل شدن لاروهای باقیمانده، به شفیره ادامه یافت و تغییرات ژنتیکی القا شده در سلول‌های پیکری دیسک های فرضی بال منجر به شکل گیری کلون های جهش یافته روی تیغه‌ی بال شد.

جهش های نقطه‌ای، شکست کروموزوم و نوترکیبی میتوزی، یک لکه ایجاد می کنند؛ در حالی که لکه های دوقلو فقط توسط نوترکیبی میتوزی تولید می‌شوند.

بنتازون که به عنوان جهش زا شناخته نمی شد، به تست های لکه‌ی بال در آمیزش های HB، جواب مثبت داد.

مولینات هم در آمیزش های استاندارد و هم در آمیزش های HB جواب مثبت داد.

تیوبنکارب فقط برای آمیزش های استاندارد آن هم با بالاترین غلظت (10 میلی مولار) جواب مثبت داد.

نهایتاً تری فلورالین، که در مورد جهش زایی مفصلاً مطالعه شده است، در مورد آزمون لکه‌ی بال برای هر دو نوع آمیزش، جواب مثبت داد.

1- مقدمه مشخص شده است که بسیاری از مواد به خودی خود جهش زا نیستند، ولی بعد از وارد شدن به بعضی مسیرهای متابولیک، به مشتقاتی تبدیل می شوند که می توانند با DNA واکنش دهند.

فعالسازی پیش جهش زاها در ابتدا توسط کمپلکس آنزیمی سیتوکروم P-450 انجام می شود.

این کمپلکس آنزیمی قابلیت متابولیزه کردن مواد بسیاری را دارد.

بیشتر خصوصیات مسیرهای متابولیسمی که به اندازه‌ی کافی مطالعه شده اند، شباهت اساسی در بین گونه های متفاوت دارد.

با این همه، تبدیلات زیستی که پیش جهش زاها را به جهش زاها تبدیل می کنند می توانند در گونه های مختلف، متفاوت باشند.

تا کنون چندین استراتژی برای مطالعه‌ی اثرات جهش زا، معلول فعال شدن پیش جهش‌زاها در سیستم های زیستی متفاوت مثل میکروارگانیسم ها، گیاهان، دروزوفیل و سلول های پستانداران، استفاده شده است.

بدون تردید شناخت مسیرهای متابولیسمی برای بررسی اثر جهش زایی علف کش ها لازم است زیرا بعضی از آنها برای فعال شدن باید در یک مسیر متابولیسمی تبدیل شوند.

آزمون جهش و نوترکیبی پیکری بال (SMART) در مگس سرکه، برای پیکری سریع و ارزان آسیب های ناشی از سم های جهش زا طراحی شد.

اهمیت SMART در این است که اثرات را در زیوه و در حضور فرآیندها متابولیک بررسی می کند.

به علاوه باید به یاد داشته باشیم که سیستم های فعالسازی متابولیک در مگس سرکه بسیار شبیه این سیستم ها در پستانداران است.

در دوران جنینی سلول های دیسک‌های فرضی به طور میتوزی تقسیم می شوند و بسیاری از جهش های نقطه‌ای، حذف ها، نوترکیبی های میتوزی و جدا نشدن ها، در بال مگس سرکه قابل دیدن است.

اگر در یکی از سلول های دیسک های فرضی جهشی ایجاد شود، این سلول یک کلون از سلول‌های جهش یافته ایجاد می کند که فنوتیپ یک مارکر مشخص را نشان می دهند.

استفاده از سویه های با فعالسازی زیستی بالا (HB)، که خصوصیت آنها فعال تر بودن سیتوکروم P-450 است، پیدا کردن پیش جهش زاهای دسته های مختلف را تسهیل می‌کند.

در حال حاضر استفاده از علف کش ها از مجموع استفاده از حشره‌کش‌ها و قارچ‌ کش‌ها بیشتر دست دیدگاه عمومی این است که علف کش ها برای پستانداران تاثیر زیادی ندارند.

ولی نتایج تحقیقات اخیر نشان می دهد که علف کش ها، تاثیراتی بر روی پستانداران هم دادند.

در این نوشته نتایج آزمون SMART در مگس سرکه برای علف کش های نامبرده شده، آورده شده است.

بنتازون یک نوع تیادیزین (thiadizine) است.

مولینات و تیوبنکارب از تیوکاربامات ها (thiocarbamates) هستند و تری فلورالین یک نوع دی نیتروآنیلین (dinitroaniline) است.

در سویه‌ی متفاوت، استاندارد و زیست فعالسازی زیاد، برای مشخص شدن نقش متابولیسم بر اثرات جهش زایی، استفاده شده اند.

از آنجا که علف کش ها پس از مصرف، جزء آلودگی های محیط زیست محسوب می‌شوند، این نوشته به آلودگی محیط زیست مربوط می شود.

2- روشها و ابزارها سویه ها: برای آمیزش استاندارد، ماده‌هائی flr3/TM3, Bds با نرهای mwh آمیزش داده شده اند.

برای آمیزش HB ماده های flr3/TM3, Bds NORR/NORR; با نرهای mwh NORR/NORR; آمیزش داده شدند.

دستورالعمل تجربی: تخم های ایجاد شده از هر آمیزش به مدت 8 ساعت در بطری‌های حاوی محیط کشت استاندارد ذرت و گوشت، تقویت شده با مخمر نانوایی، نگهداری شدند.

بعد از 72 ساعت، لاروها با آب جدا شده و به ویال های پلاستیکی حاوی 5/4 گرم محیط کشت مگس سرکه منتقل شدند و 9 میلی لیتر از محلول‌های آزمایشی مربوط به آنها اضافه شد.

ویال حاوی محیط کشت مگس سرکه با 5 درصد استون به عنوان کنترل منفی و با 1 میلی مولار EMS به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

لاروها تا رسیدن به مرحله‌ی شفیره روی این محیط کشت داد‌ه‌شدند.

همه‌ی آزمایش‌ها در 25 درجه‌ی سانتی‌گراد و رطوبت نسبی 68% انجام شد.

مگس های حاصل جدا شده و در محلول اتانول 70% نگهداری شدند.

هر دوی آمیزش های ST و HB دو نوع بال ایجاد می کردند که از راه مارکر Bds قابل تشخیص بودند: 1) مگس های هتروزیگوت برای مارکر، بال وحشی از لحاظ فنوتیپی، 2) مگس های هتروزیگوت برای بالانسر (balancer) با بال های دندانه- دندانه.

بال ها جدا شده و توسط محلول Faure از آن ها اسلاید تهیه شد.

هر دو روی بال با بزرگنمایی 400 برابر برای پیدا کردن لکه های جهش جستجو شد.

نوع، اندازه و تعداد لکه ها ثبت شد.

این لکه های پیکری به سه دسته تقسیم شدند: (I لکه های کوچک و منفرد، (II لکه‌های بزرگ و منفرد، (III لکه های دوقلو.

روی بال های مگس های هتروزیگوت برای وارونگی، فقط لکه هایmwh منفرد قابل تشخیص بودند زیرا کروموزوم بالانسر حاوی جهش وارونگی هیچ مارکرمناسب دیگری ندارد.

بررسی آماری: برای اندازه گیری اثر جهش زایی مشاهده شده، فراوانی لکه ها برای هر بال در هر گروه (که با ماده ای متفاوت و با غلظت متفاوت تیمار شده بودند) با فراوانی لکه ها برای کنترل منفی مربوط به همان گروه، مقایسه شد.

برای محاسبات آماری، تست دو جمله ای شرطی با سطح اهمیت 5% استفاده شد.

3- نتایج و تفسیر به استثنای بنتازون برای آمیزش های HB، علف کش های انتخاب شده در این پژوهش فقط به طور ملایم برای لارو مگس سرکه سمی بودند، پس امکان آزمایش با غلظت های تا 10 میلی مولار وجود داشت.

گستره‌ی غلظت های انتخاب شده صحت نتایج به دست آمده را تصمین می کند.

به استثنای بنتازون برای آمیزش های HB، علف کش های انتخاب شده در این پژوهش فقط به طور ملایم برای لارو مگس سرکه سمی بودند، پس امکان آزمایش با غلظت های تا 10 میلی مولار وجود داشت.

نتایج به دست آمده و برآورد جهش زایی چهار علف کش انتخاب شده در جداول 1 تا 4 خلاصه شده است (جداول در انتهای بخش آمده اند).

این جداول نتایج را برای هر دو آزمایش استاندارد و متابولیسم زیاد نشان می دهد.

به علاوه، برای هر آمیزش، بال های دو نوع زاده مقایسه شد: آنهایی که بدون وارونی بودند و ژنوتیپ ترانس هتروزیگوت داشتند و آنهایی که بالانس (balancer) داشتند.

مجموعاً 8640 بال در این آزمایش امتیازدهی شدند.

فراوانی کل لکه های ثبت شده برای یک مگس در کنترل منفی های آمیزش ST تقریباً کم است (از 13/0 تا 26/0).

همینطور برای کنترل منفی های آمیزش HB (از 16/0 تا 29/0).

بنتازون جزء گروه تیادیازین ها است.

از دو حلقه تشکیل شده است که یکی آروماتیک است ودیگری یک هتروسیکل حاوی نیتروژن و گوگرد است.

اولین بار در سال 1975 استفاده شد و برای حذف انتخابی بعضی از علف ها، بعد از روییدن محصول استفاده می شود.

بنتازون، طبق اطلاعات بانک های WHO/IPCS و DRR هیچ اثر جهش زایی برای ژن ها و کروموزوم ها و هیچ اثر تخریبی روی DNA چه در سیستم های در شیشه و چه در سیستم های در زیوه نشان نداده است.

مطالعات برای بررسی اثر سرطان زایی بنتازون، هیچ افزایشی در تعداد عده های موش نشان نمی دهند.

پس داده های به دست آمده تا کنون برای سرطان زایی و جهش‌زایی بنتازون، نشان می دهد این ماده یک سم ژنتیکی نیست.

همانطور که انتظار می رفت در آزمایش مگس سرکه‌ی ما، تاثیر جهش زایی برای بنتازون در آمیزش های استاندارد دیده نشد.

ولی در مورد آزمایش HB برای تمام غلظت ها، خصوصاً در مگس های هتروزیگوت برای مارکر، این ماده تعداد کل لکه ها را به میزان قابل توجهی افزایش داد (جدول 1).

این افزایش بیشتر در مورد القای لکه‌های منفرد کوچک بوده است.

برای آزمایش های HB امکان اعمال غلظت های بیشتر از 5 میلی مولار به علت اثر کشنده بر روی لارو، وجود نداشت.

این نتایج نشان می دهد که حداقل در مورد لکه‌های بال مگس سرکه: متابولیت های اصلی حاصل از تغییر و تجزیه‌ی بنتازون، به مراتب ازخود آن جهش زاتر هستند.

مقایسه‌ی نتایج حاصل از بال های هتروزیگوت برای مارکر و هتروزیگوت برای بالانسر، نشان می دهد که بنتازون قادر است نوترکیبی را افزایش دهد، زیرا لکه های جهش یافته در مارکر- هتروزیگوت ها، در همه‌ی غلظت ها افزایش داشته است.

مولینات یک علف کش تیوکرباماتی است که اولین بار در سال 1954 معرفی شد.

از آن برای از بین بردن بعضی علف های برنج و غلات دیگر استفاده می شود.

این ماده توسط آنزیم های میکروزومی به سولفاکسید مولینات متابولیزه شده و توسط سیستم گلوتایتون محلول، شکسته می شود.

نتایج تجربی نشان می دهد، مولینات آنزیم هایی مانند آلدهید دهیدروژناز و استیل کولین استراز را مهار می کند.

کاهش باروری در موش هم، تحت اثر این ماده دیده شده است.

مولینات بر روی Salmonella و E.coli تاثیری نداشته و روی دیگر پروکاریوت‌ها هم بی تاثیر است.

بعضی از آزمایش‌ها افزایش جهش در ژن ها، ناهنجاری کروموزومی و تعویض قطعه بین کروماتیدهای خواهری را تحت تاثیر این ماده، در سلول های لیمفومای موش نشان می دهند.

یک بررسی جدید توسط سازمان حفاظت از محیط زیست آمریکا می گوید شواهدی برای سرطان زایی مولینات وجود دارد ولی آنقدر قوی نیست که در انسان هم سرطان زا باشد.

نتایج به دست آمده در مطالعه‌ی حاضر (جدول 2) نشان می دهد که علف کش به طور مختصر تعداد لکه های کوچک و منفرد را در هر دو سویه و هر دو آمیزش، افزایش می دهد ولی تنها با بیشترین غلظت (10 میلی مولار) هیچ شاهدی مبنی بر افزایش نوترکیبی توسط این ماده دیده نشد.

تیوبنکارب جزء تیوکاربامات ها است.

از یک دی اتیل تیوکاربامات متصل به یک واحد کلروبنزیل تشکیل شده است.

در سال 1970 به بازار آمد و به طور گسترده برای کنترل علف استفاده می شود.

تیوبنکارب قبل از رویش علف با مهار ساقه های در حال رویش، عمل می کند.

این ماده آنزیم هایی از قبیل استیل کولین استراز، آلدهید دهیدرژناز و آدنوزین تری فسفاتاز را مهار می کند و توسط سیتوکروم P-450 متابولیزه می شود.

به نظر می رسد، بیشتر نتایج به دست آمده تا کنون، برای جهش زایی و سرطان‌زایی این ماده، منفی است.

هیچ تاثیر در آزمایش ایهز(Ame's test) یا آزمایش‌های مربوط به ناهنجاری های کروموزومی، از این ماده دیده نشده است (شرح کامل آزمایش ایهز در بخش های دیگر آمده است).

در کار حاضر تیوبنکارب تاثیر جهش زایی را فقط در آمیزش استاندارد و در بالاترین غلظت (10 میلی مولار) نشان داد.

در عوض هیچ اثر جهش زایی از این ماده در آمیزش های HB دیده نشد که این احتمالاً مربوط به افزایش سرعت تجزیه‌ی این ماده در اثر متابولیسم زیاد است.

در کل، تیوبنکارب پتانسیل ضعیفی برای جهش زایی نشان می دهد.

نتایج حاصل برای تاثیر نوترکیبی زایی منفی بوده است.

تری فلورالین اولین بار در سال 1963 مورد استفاده قرار گرفت.

این دی نیتروآنیلین به شدت در کشاورزی به عنوان علف کش قبل از رویش و قبل از کاشتن استفاده می‌شود و در مورد گستره‌ی وسیعی از غلات موثر است.

تاثیر این ماده روی علف ها، جلوگیری از گسترش ریشه از طریق مهار میتوز است.

نتیجه‌ی تمام بررسی هایی که تا کنون برای جهش زایی این ماده انجام شده منفی بوده است یا به اندازه‌ی کافی محکم نبوده‌است ولی بعضی از آزمایش ها افزایش ناهنجاری ها در تعداد کروموزوم‌ها را در گیاهان نشان می دهند.

در این پژوهش، تری فلورالین فراوانی لکه های کوچک و منفرد را در آمیزش ST افزایش داد.

برای مارکر- هتروزیگوت ها این افزایش فقط در بالاترین غلظت معنی دار بود در حالی که در بالانسر- هتروزیگوت ها تاثیر مثبت از غلظت 2 تا 10 میلی مولار دیده شد (جدول 4).

در آمیزش HB، پاسخ در مورد بال های مارکر- هتروزیگوت بسیار مشهود بود تا جایی که تغییر معنی دار در تعداد لکه ها حتی در غلظت 5/0 میلی‌مولار هم دیده شد.

به علاوه افزایش معنی دار در تعداد لکه های منفرد بزرگ هم از غلظت 2 تا 10 میلی مولار، در این آمیزش ها مشاهده شد.

پس داده های ما با داده‌های آزمایش های قبلی که اثر جهش زایی و سرطان زایی برای تری فلورالین روی مگس سرکه و موش نشان می دادند، در توافق است.