دانلود تحقیق سرطان زایی و جهش زایی مواد آلی جدا شده از ذرات معلق در هوا، در سلول‌های پیکری در وزوفیلا ملانوگاستر

آزمون ایمز آزمونی ساده است که توسط Bruce Ames برای مشخص کردن اینکه آیا یک ماده اثر جهش زایی دارد یا نه، طراحی شده است.

یک سویه‌ی Salmonella Typhimurium که دارای جهشی است که یک آنزیم مسیر بیوسنتزی اسید آمینه‌ی هیستیدین از کار بیافتد، روی محیط کشت بدون هیستیدین کشت داده می شود.

در حالت عادی تعداد کمی سلول، به علت وقوع جهش‌های برگشت، روی محیط رشد می کنند (شکل 1).

برای اینکه ماده ای مورد آزمون قرار گیرد، دیسک کاغذی را به آن ماده آغشته می کنند و در وسط محیط کشت بدون هیستیدین قرار می دهند.

اگر ماده‌ی مورد نظر جهش زا باشد، در فاصله ای از دیسک حلقه ای از کلونی های واجد جهش برگشت تشکیل می شود و اگر جهشزا نباشد، هیچ حلقه‌ی قابل تمایزی تشکیل نمی شود.

فاصله‌ی حلقه‌ی کلونی ها به قدرت جهش زایی ماده ربط دارد، طوری که هرچه قدرت جهش زایی بیشتر باشد، فاصله‌ی حلقه بیشتر خواهد بود.

چون بعضی از مواد فقط بعد از ورود به بدن و قرار گرفتن تحت اثر آنزیم های سلول، خاصیت جهش زایی پیدا می کنند، گاهی ماده‌ی مورد آزمایش را قبل از قرار دادن روی دیسک با عصاره‌ی کبد مخلوط می کنند.

References: 1) B.N.Ames, J.

McCann and E.

Yamasaki, Methods for detecting carcinogens and mutagens with Salmonella/ mammalian microsome mutagenicity test, mutation Res.

31, 347-364 (1975).

سرطان زایی و جهش زایی مواد آلی جدا شده از ذرات معلق در هوا، در سلول‌ های پیکری در وزوفیلا ملانوگاستر خلاصه مخلوط های پیچیده ای که از فیلترهای هوایی که به مدت 24 ساعت در دو روز متفاوت و هر روز در دو مکان متفاوت در شهر مکزیکوسیتی کار گذاشته شده بودند، تجزیه تحلیل شدند.

برش های مواد آلی از ذرات معلق در هوای کوچکتر یا برابر 10 میکرومتر (PM10) یا از کل ذرات معلق (TSP) جدا شدند.

این برش های مواد آلی در آزمون جهش ها و نوترکیبی های پیکری (SMART).

در بال مگس سرکه و در دو آمیزش متفاوت بررسی شدند.

همچنین از آزمون عیار سنجی سالمونلا (Salmonella)/ میکروزوم با استفاده از سویه‌ی TA98 استفاده شد.

وجود هیدکربن های پلی سیکلیک آرومات (PAH) در برش ها، توسط کروماتوگرافی گازی مشخص شد.

جهش زایی و سرطان زایی (Genotoxicity) مشاهده شده در دو سیستم قابل مقایسه بودند، جهش‌زاهای غیرمستقیم اثر بیشتری از جهش زاهای مستقیم ایجاد می کردند.

مقادیر و همینطور میزان جهش زایی مواد جدا شده در هر دو مکان، در دوم ماه مارس بیشتر از هفتم ماه July سال 1991 بود (آزمایش در دو روز متفاوت انجام شد).

در هر دو سیستم PM10 از TSP مسمی تر بود.

این نتایج حساسیت آزمون SMART برای بال مگس سرکه- که یک آزمون در زیوه‌ ی یوکاریوتی است.

را به عنوان یک نمایشگر زیستی از آلودگی محیط زیست، مرتبط با ذرات معلق در هوا، نشان می دهند.

1- مقدمه آلودگی های محیط زیست، خصوصاً آلودگی های هوا، بسیار مورد توجه هستند زیرا جمعیت های تحت تاثیر آنها، به طور دائمی در معرض این آلودگی ها قرار دارند.

از زمان های گذشته مشخص شده بود که ضایعات سوختی حاصل از مصرف سوخت‌های فسیلی در نیروگاه‌ها، کارخانه ها، منازل و وسایل نقلیه، حاوی موادی هستند که ممکن است سلامت انسان را به مخاطره بیاندازند.

در میان آلوده کننده‌های متفاوت، آلودگی های هوایی به علت وجود جهش زاها و سرطان زاهای مختلف مثل فیبرهای معدنی، هیدروکربن های پلی سیکلیک آروماتیک (PAH) و مشتقات اکسیژنی و نیتروژنی آن ها، خطرناک تر هستند.

قبلاً مشخص شده است که PAH های همراه با ذرات از PAHهای همراه با گاز، جهش زاتر هستند.

از آن جایی که ترکیبات آلی جذب سطح این ذرات معلق در هوا می شوند،‌حتی آلودگی های مختصر هم ممکن است خطرناک باشند زیرا هر نفر در طول روز حدوداً 10000 تا 20000 لیتر هوا استنشاق می کند.

برش های جدا شده‌ی مواد آلی از ذرات معلق شهری که از چند شهر متفاوت به دست آمده بودند، اثر سرطان زایی در موش و جهش زایی در گروهی از آزمون‌های زیستی داشته اند.

آزمونی که صحت آن بیشترین مقبولیت را در مطالعه‌ی جهش زایی و سرطان زایی ترکیبات محیطی دارد، آزمون سالمونلا/ میکروزوم (Salmonella/Microsome) است.

این آزمون نه تنها برای بررسی یک ترکیب منفرد به کار می رود، بلکه برای بررسی مخلوط های پیچیده مانند ذرات معلق در هوا، گازوئیل، گازهای خروجی اتومبیل و دود سیگار نیز کاربرد دارد.

به هر حال، علاوه بر این تست پروکاریوتی در شیشه، به تست های یوکاریوتی با دقت واختصاصی بودن زیاد؛ سرعت زیاد و هزینه‌ی کم احتیاج است تا به نتایج قطعی تری برسیم.

یک آزمون کارآمد؛ پرکاربرد، کوتاه مدت و در زیوه‌ی یوکاریوتی که انواع مختلف جهش و نوترکیبی میتوزی را مشخص می‌کند، آزمون جهش و نوترکیبی سوماتیک (SMART) در بال های مگس سرکه است.

اساس این آزمون از بین رفتن القایی هتروزیگوسیتی برای دو مارکر مغلوب سلول‌های بال در دیسک های فرضی بال است.

از بین رفتن حالت هتروزیگوت می‌تواند به کلن های سلول های جهش یافته ای منجر شود که در نهایت به شکل لکه‌های پیکری که فقط یکی از دو فنوتیپ را نشان می دهند، در می آیند.

این آزمون جهش زایی پیکری اعتبار زیادی پیدا کرده است، طوری که تا کنون 400 ماده و ترکیب توسط آن تجزیه تحلیل شده اند.

در اینجا ما نتایج به دست آمده از آزمون SMART در بال مگس سرکه را، برای ذرات معلق در هوا، جدا شده از شهر مکزیکوسیتی، ارائه می دهیم.

همچنین این نتایج را با نتایج حاصل از آزمون سالمونلا/ میکروزوم برای مواد مشابه، مقایسه می کنیم.

2- روش ها و ابزارها نمونه های هوا فیلترهای از جنس فایبرگلاس حاوی ذرات محلول که با سمپلرهای ظرفیت بالا در دو نقطه‌ی شهر مکزیکوسیستی جدا شدند.

محل های جداسازی یکی مرسد (Merced) در مرکز شهر و دیگری پدرگال (Pedregal) در جنوب غربی شهر، بودند.

هر دو نقطه دارای ترافیک وسایل نقلیه موتوری هستند، خصوصاً صبح زود و بعد از ظهرها ولی در مرسد در تمام طول روز فعالیت های تجاری و تفریحی وجود دارد.

دو نوع سمپلر با ظرفیت زیاد استفاده شد، یکی برای کل ذرات معلق (TSP) و دیگری که حجمش بین 10 میکرومتر و کمتر قابل تنظیم بود برای جدا کردن ذراتی با قطر 10 میکرومتر و کمتر (PM10) استفاده شد.

مواد آلی توسط 250 میلی لیتر متانول و به مدت 6 ساعت از فیلترها جدا شدند.

مواد جدا شده تغلیظ شده و برای آزمایش های زیستی و شیمیایی تقسیم شدند.

آزمون لکه های بال در مگس سرکه تغذیه‌ی لاروها.

یک میلی لیتر از مواد جدا شده تا نزدیک خشک شدن حرارت داده شد و دوباره در 1 میلی لیتر اتانول خالص حل شد.

رقیق این محلول ها توسط اتانول 3 درصد و Tween-80 3 درصد در آب مقطر ساخته شد و سپس برای ساختن محیط کشت مگس سرکه (Drosophila instant medium) استفاده شد.

رقت های به کار رفته با 76/9 مترمکعب از هوای نمونه گیری شده در هر میلی لیتر و 44/2 مترمکعب از هوای نمونه گیری شده در هر میلی لیتر، متناسب هستند.

تخم ها از بطری های حاوی مگس های در سن مناسب و با تغذیه‌ی مناسب که 8 ساعت در این بطری ها قرار داشتند جدا شد.

سه روز بعد لاروها از این بطری ها خارج شدند و سپس داخل و یال های پلاستیکی حاوی 5/1 گرم پودر محیط کشت و 5 میلی لیتر محلول آزمایش قرار گرفتند.

لاروها برای ادامه‌ی رشد به مدت 48 ساعت در همین محیط ها باقی ماندند.

محلول های کنترل هم وجود داشت و ضمناً 7، 12- دی متیل بنزآنتراسین به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

همه آزمایش ها در دمای 25 درجه سانتی گراد و رطوبت نسبی 65% انجام شدند.

تست نوترکیبی و جهش سوماتیک.

دو آمیزش از مگس ها استفاده شد: 1) آمیزش استاندارد (ST): ماده های flr3/In (3LR) TM3, ripp sep L(3) 89Aabx34e/e Bds و نرهای mwh.

2) آمیزش با زیست فعالسازی زیاد (HB): ماده های ORR; flr3/In (3LR) TM3, ripp sep L(3) 89Aabx34e/e Bds و نرهای mwh.

مگس های زنده مانده از ویال های تیمار جدا شدند و مگس های ترانس هتروزیگوت (mwh flr+/mwh+flr3) در اتانول 70 درصد نگهداری شدند.

لکه ها طبق دستورالعمل استاندارد شمارش شدند.

بررسی داده و آنالیز آماری.

داده های لکه های بال توسط برنامه‌ی کامپیوتری SMART بررسی شدند.

آنالیزهای آماری هم به همین شکل انجام شد.

براساس تعداد کلون های mwh، تعداد بال های بررسی شده و تعداد سلول های امتیاز دهی شده در هر بال (تقریباً 400/24 عدد)، فراوانی تشکیل کلون به ازای هر چرخه‌ی سلولی و 5 10 سلول محاسبه شد.

هیچ تصحیحی روی اندازه‌ی کلونی انجام نشد.

آزمون سالمونلا/ میکروزوم پستاندار نمونه های این آزمون تا نزدیک خشک شدن، تبخیر شده و دوباره در DMSO حل شدند.

اینها برای جهش زایی در سویه‌ی TA98 از Salmonella Typhimurium با وجود و بدون قطعه‌ی S9 از پستانداران و توسط آزمون ایهز، بررسی شدند.

به آگار در 45 درجه‌ی سانتی گراد، 1/0 میلی لیتر از نمونه، 1/0 میلی لیتر از محیط کشت مایع باکتری و 5/0 میلی لیتر آب استاندارد یا مخلوط S9 اضافه شد.

مخلوط S9 از کبد موش تهیه شد.

DMSO به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

از پیکرولونیک اسید (picrolonic acid) به عنوان کنترل مثبت برای نمونه های بدون S9 و از بنزوپیرن به عنوان کنترل مثبت نمونه های واجد S9 استفاده شد.

بعد از 48 ساعت کشت در 37 درجه، تعداد جهش های برگشت his+ در هر پلیت شمارش شد و به عنوان جهش برگشت به ازای هر پلیت گزارش شد.

3- نتایج و تفسیر ذرات معلق در هوا (TSP, PM10) که در دو نقطه‌ی شهر مکزیکوسیتی جمع آوری شده بودند، برای بررسی جهش زایی تحت دو آزمون SMART درسلول های بال مگس سرکه و آزمون سالمونلا/ میکروزوم (در دو حالت S9 دار و بدون S9) قرار گرفتند.

یک بررسی شیمیایی برای مشخص شدن وجود PAHها از طریق کروماتوگرافی گازی انجام شد.

مواد جدا شده در روز دوم AVG بیشتر از بیست و هفتم JUL بودند و در هر دو محل انجام بررسی TSP بیشتر از PM10 بود (جدول 1).

(جداول به انتهای مقاله اضافه شده اند).

وجود PAH در این نمونه ها تایید شد ولی امکان تعیین غلظت دقیق انواع PAHهای موجود نبود.

به علاوه نیتروپلی سیکلیک آروماتیک هیدروکربن های زیر پیدا شدند: 1، 8- دی نیترونفتالین (1,8-dinitronaphtalene)، 1،5- دی نیترونفتالن، 2، 7- دی نیتروفلورن (2,7-dinitrofluorene)، 1- نیتروپیرن و 6- نیتروبنزپیرن.

در همه‌ی تست های سالمونلای سویه‌ی TA98، فراوانی های بالاتری از برگشت در هر پلیت دیده می شد وقتی که مخلوط S9 اضافه شده بود، به استثنای PM10 از دوم AUG و منطقه پدرگال (جدول 3).

بدون اضافه کردن S9، مواد جدا شده در مرسد فعالیت بیشتری نسبت به مواد جدا شده در پدرگال نشان می دادند و دوباره با یک استثناء در همه‌ی تست هایی که به آنها S9 اضافه شده بود، فراوانی های برگشت به طرز معنی دارای نسبت به مقادیر کنترل افزایش نشان می داد (جدول 2).

نتایج به دست آمده از لکه های بال مگس سرکه در آمیزش های ST و HB به ترتیب در جدول های 3و4 آمده است.

در این جداول، نتایج مربوط به هر نوع لکه به طور جداگانه آمده است.

واحد غلظت استفاده شده برای هر تیمار با توجه به مقدار متناظر هوای نمونه گیری شده، محاسبه شده اند.

در سری اول، غلظت 44/2 مترمکعب بر میلی لیتر استفاده شده است.

برای سری های تکرار این غلظت به 76/9 مترمکعب بر میلی لیتر افزایش داده شده است.

در آمیزش های ST، افزایش معنی دار تعداد لکه‌ها در هر بال در 6 تا 16 سری دیده شد ولی نتایج 10 سری دیگر ناقص و غیرقابل نتیجه‌گیری بود.

در آمیزش های HB، 10 سری جواب مثبت، 4 سری جواب منفی و 2 سری پاسخ غیرقابل نتیجه گیری دادند.

نتایج مثبت عمدتاً به افزایش تعداد لکه های منفرد و کوچک مربوط می شود.

تنها پاسخ مثبت به دست آمده در مورد لکه های بزرگ و منفرد، مربوط به آمیزش HB (27 JUL/ پدرگال برای TSP 76/9) می شود.

همه‌ی پاسخ های مثبت در مقایسه با انواع لکه های ایجاد شده توسط کنترل مثبت (دی اتیل بنزآنتراسین) افزایش کمتری در تعداد لکه ها نشان می دهند.

در آمیزش های ST، به طور کلی قطعه های PM10 جهش زاتر از قطعه‌های TSP بودند.

این وضعیت در آمیزش های HB شدیدتر بود به طوری که تنها دو استثناء وجود داشت.

در هر دو نوع آمیزش میزان جهش زایی مواد جدا شده از مرسد بیشتر از مواد جدا شده از پدرگال بود.

برای اینکه بتوانیم نتایج دو نوع آزمون را مقایسه کنیم، فراوانی تصحیح شده به وسیله‌ی کنترل شکل گیری لکه به ازای هر 5 10 سلول به دست آمده از آزمون لکه‌های بال با 76/9 مترمکعب بر میلی لیتر، در برابر نتایج به دست آمده از آزمون سالمونلا/ میکروزوم در شکل 1 رسم شدند.

وجود PAH در تمامی نمونه های بررسی شده مشخص است، با این حال، امکان تطبیق دادن تاثیرات مشاهده شده در دو روش وجود نداشت.

دلیل اصلی این است که علاوه بر ترکیبات آروماتیک، مواد جدا شده مدار بسیار زیادی از مواد آلی دیگر داشتند.

این مواد ممکن است اثرات بسیار متنوعی روی موجودات زنده نشان دهند، چه به عنوان پیش جهش زا چه به عنوان جهش زای مستقیم.

با این وجود امکان پیدا کردن همخوانی های مختصری بین آنالیزهای شیمیایی و دو آزمون زیستی وجود دارد.

به عنوان مثال، مواد TSP از دوم آگوست در مرسد، پاسخ بیشتری در آزمون سالمونلا و در زمان عدم حضور S9 دادند و در آمیزش ST مگس سرکه فعال تر از آمیزش HB بودند.

نمونه حاوی بالاترین مقدار نیترو- PAH بود و تحقیقات قبلی نشان داده است که مشتقات نیترودار PAHها به شکل جهش زای مستقیم عمل می کنند.

این نیز قابل توجه است که آزمون سالمونلا با مخلوط S9 مانند آزمون مگس سرکه با سویه های HB جواب می دهد.

در هر دو ارگانیسم، نمونه‌ی TSP از بیست و هفتم JUL در پدرگال، بالاترین فعالیت را نشان داد که احتمالاً به علت وجود مقادیر زیاد جهش‌زاهای غیر مستقیم می باشد.

در کل از شکل 1 مشخص است که یک توافق خوب بین دو روش وجود دارد.

تفاوت‌هایی که مشاهده می شود ممکن است تحت اثر خواص ذاتی هر یک از سیستم‌ها باشد.

به عنوان مثال در آزمون سالمونلا/ میکروزوم، فعالسازی متابولیکی به شکل در شیشه انجام می شود ولی در آزمون SMART مگس سرکه به شکل در زیوه صورت می گیرد.

به علاوه موادی که در آزمون مگس سرکه امتحان می شوند، از راه بلعیده شدن به سلول های هدف می رسند.

یک تفاوت دیگر بین دو سیستم حضور آنزیم نیتروردکتاز در سالمونلا است که می تواند مشخص شدن ترکیبات نیتروآروماتیک را تسهیل کند.

چندین پژوهش نشان داده اند که پاسخ سالمونلا با حضور S9 به مخلوط های پیچیده‌ی PAH تحت تاثیر بر همکنش عوامل هسته دوست با کمپلکس P450 میکروزومی می باشد.

ولی در سیستم های زنده این ترکیبات از هم جدا می شوند و فعالسازی آن ها به شکل موثرتری صورت می گیرد.

با این دیدگاه می توان نتیجه گیری کرد که نتایج به دست آمده در آزمون SMART مگس سرکه در مورد این ترکیبات نتایج واقعی تری می دهد.

نتایجی که در این جا ارائه شده اند نشان می دهند که آزمون SMART بال مگس سرکه یک آزمون حساس و دقیق است و برای بررسی جهش زایی وسرطان زایی مواد معلق در هوا بسیار مناسب است.