نکات کلیدی پایداری نوکلئیک اسیدها : اگر به نظر میرسد که ساختار رشته های دوبل DNA و RNA بوسیله پیوند هیدروژنی محکم میگردند ، اما این چنین نیست با ندهای هیدروژنی بای جفت شدن بزها مخصوص هستند ، اما پایداری مار پیچ نوکلئیک اسید نتیجه اثر متقابل آب گریزی و دو قطبی دو قطبی بین جفت بازهای آلی میباشد .
اثر اسید : وضعیت بسیار اسیدی ممکن است باعث تجزیه نوکلئیک اسیها به اجزایشان شود : بازها قند و فسفات اسیدهای ضعیف سبب هیدرولیز پیوند بازهای پودینی گلیکوزیلی تا اسید بدون پودین بدست آید شرایط شیمیایی پیچیده برای انتقال بازهای ویژه توسعه داده شده است و اساس توالی شیمیایی DNA است .
اثر قلیا : PH بالا DNA و RNA را تخریب میکند بوسیله تغییر در وضعیت تاتو مری بارها و قطع بازهای هیدروژنی ویژه RNA همچننی مشکوک به هیدرولیز در PH بالا بوسیله شرکت در OM-Z در فرایند شکستگی درون مولکولی ستون فقودی استر میباشد .
بعضی از ترکیبات شیمیایی مانند دوره و فرمامید میتوانند DNA و RNA را در RM طبیعی بوسیل قطع نیروی آب گریزی بین بازهای آلی تخریب کنند .
چسبندگی : DNA خیلی دراز و نازک است و محلولهای DNA یک چسبندگی بالایی دارند مولکوهای DNA دراز مستعد شکستگی در یک محلول از طریق لرزش میباشند این پروسه ها میتوانند برای تولید DNA با یک طول متوسط و مشخص استفادع شود .
چگالی شناوری : DNA دارای چگالی حدود میباشد و میتواند آنالیز شود خالص شود بوسیله قابلیتش در متعادل کردن در چکالی شناوری اش در یک شیب چگالی کلراید سندیم تشکیل شده در یک سانتریفوژ چگالی دقیق DNA بعلت وجود G+C میباشد و این تکنیک ممکن برای تجزیه DNA های ترکیبات مختلف استفاده شود موضوعات مرتبط : ساختار نوکلئیک اسیدها ویژگیهای دمایی و اسپکتروسکوبی نوکلئیک اسدیها پایداری نوکلئیک اسیدها : در اولین نگاه ممکن است بنظر میردس که مارپیچ دو گانه DNA و ساختار ثانویه RNA بوسیله باندهای هیدروژنی بین جفت بازها محکم میگردند .
در حقیقت اینطور نیست مانند پروتئینها ( موضوع A4 را ببینید ) حضور باندهای هیدروژنی بین یک ساختار بطور نرمال ایجاد پایداری نمیکند این بخاطر اینست که یکی باید بررسی شود اختلاف در انرژی بین انها ، در مورد DNA وضعیت تک رشته ای پیچ خورده و ساختار دو رشته ای توجه داشت باندهای هیدروژنی بین جفت بازها در DNA دو رشته ای صرفاً جایگزین میشد از نظر قدرت و انرژی که اگر مولکول DNAتک رشته می بود در محلول آبی ، فقط با مولکولهای آب برقرار میگردد پیوند هیدروژنی یقیناً در شرایط مورد نیاز برای جفت شدن بازها در یک زنجیریه دوتایی دخالت دارد DNA دو رشته ای فقط موقعی تشکیل خواهند شد که مکمل یکدیگر باشند اما این پیوند در پایدار بودن مارپیچ شرکت نمی کنند ریشه این پایداری در جای دیگری نهفته است مهمترین مسئله بین جفت بازهای آلی تداخل میباشد از آنجائیکه آن بهتر است که از نظر انرژی آب را به روش متراکم مردن آن از محیط زوجهای آب گریز دور کرد مقدار زیادی از آب در شبکه پیوندهای هیدروژنی وارد میشودد تد اخل عمل بین دوقطبی های باردار موجود روی بازها را بیشتر میکنئ حتی در DNA تک رشته ای بازها تمایل دارند تا رروی همدیگر متراکم شوند این تراکم شدن ، در زنجیره دوتایی DNA بیشتر میگردد .
پدیده آب گریزی باعث میشود که این حالت بهترین حالت از نظر انرژی زایی باشد .
اثر اسید : در اسیدهای قوی و دمای بالا بعنوان مثال در اسید کلریک در دمای بیش از 100 درجه سانتی گراد ، اسید نوکلئیک بطور کامل به ا جزایش تفکیک میشود بازها ، ریبوز ، دی اکسید ریبوز و فسفات درحضور اسیدهای معدنی رقیق تر به عنوان مثال به PH=3-4 ، باندهای راحت تجزیه میشوند به طور انتخاب می شکنند این پیوندها آن پیوندهای گلیکوزیلی هستند که بازهای پورین را به حلقه قندریبوز متصل میکنند و با شکستن آنها اسید نوکلئیک به صورت بدون پودین میشود روشهای شیمیایی پیچیده تری به دست آمده ا ند که بطور ویژه بازها را در بر دارند این شکل اساس توالی شیمیایی در DNA است که توسط ماکسیم و گیلبرت ارائه شد .
اثر قلیا بر DNA : افزایش PH بالای دامنه فیزیو لوژیکی (PH=7-8) اثرات دقیق بیشتر روی ساختار DNA دارد .
اثر قلیا تغییر دادن وضعیت توتومریک بازها است این اثر میتواند با مراجعه به مدل ترکیب سیکلو هگزان مشاهده شود مولکول در تعادل است بین وضعیت توتومریک کتو و انول میباشد در PH طبیعی ، ترکیب عمدتاً در حالت keto میباشد افزایش PH سبب میشود تغییر به تشکیل اینولات میگردد که مولکول پروتون از دست میدهد زیرا بار منفی با پایداری بیشتی بر روی اتم اکسیژن الکترونگاتیو مطابقت دارد ساختار گوانین نیز تمایل پیدا میکند به تشکیل اینولات در PH بالا و تغییرات شبیه نیز در ساختار بازای دیگر روی میدهد این اثرات باند هیدروژنی بین جفت بازها را تحت تاثیر قرار میدهد ونتیجه آن اینست که ساختار دو رشته ای DNA بشکند واین است که DNA واسرشت میگردد .
RNA : در RNA هم واسرشت مشایه در مناطقی از مارپیچ در PH بالا صورت میگیرد اما این اثر تحت تاثیر حساس بودن RNA برای هیدرولیز در محیط قلیایی است واسرشت شدن DNAدر محیط با PH بالا این مسئله است بخاطر اینکه گروه در RNA وجود دارد که دقیقاً در جایی قرار گرفته در شکستن ستون RNA از طریق اعمال نیروی درون مولکلی بر روی فسفات در محل اتصال فسفودی استر دخالت میکند این مسئله بیشتر پیشرفت میکند در شرایط با PH بالا ویرا –OH بعنوان یک باز عمومی عمل میکند .
محصول آن ایجاد آزاد و و فسفودی استر حلقوی اس که بعداً به یا مونو فسفات هیدرولیز میشود حتی در PH طبیعی هم RNA نسبت به DNA برای هیدرولیز شدن مستعد تر است که DNA البته فاقد است این مسئله پذیرفتی است که چرا DNA بازشده تا با دی اکسی ریبوز ترکیب شود چون کاربری آن به پایداری بالای انرژی احتیاج دارد .
شکل ص 38 شکسته شدن درون مولکولی پیوندهای فسفودی استر در محیط قلیایی واسرشت شیمیایی : تعدادی از عوامل شیمیایی میتوانند سبب واسرشت DNA یا RNA در محیط طبیعی شوند بهترین مثال این ترکیبات اوره و فرمامید میباشد غلظت بالایی این عوامل ( چندین مولا ر) باعث تخریب باندهای هیدروژنی در محلول آبی متراکم میگردد معنی آن اینست که پایداری انرژی در ساختار ثانوی اسید نوکلئیک ازطر یق خارج کردن آب در بین پیوندهای آب گریز باز صورت گرفته ضعیف میشود و پیوندهای مستمر واسرشت شدن میشوند .
چسبندگی : ی DNA سلولی خیلی دراز و باریک است و از نظر فنی نسبت به طولی زیادی دارد DNA حدود دو نانومتر قطر دارد و ممکن است در حدود میکرومر یا میلی متر یا ؟
مثل کرموزومهای یوکاریونی چند سانتی متر باشد برای دید بهتر ، اگر DNA قطری شبیه ماکارونی داشته باشد در آن صورت کروموزوم Ecoli ، دارای 6/4 میلیون زوج باز طولی برابر 1 کیلومتر دارد بعلاوه DNA یک مولکول محکمی است سختی آن میتواند شبیه به ماکارونی نیم پخت باشد بهمین علت است که محلولهای DNA چسبندگی زیادی دارند بعلاوه مولکولهای بلند DNA میتوانند به راحتی با نیروی حرکتی آسیب ببینند یا با استفاده از ولتراموند با توان بالا ، که در نهایت غلظت محیط کم میشود حساسیت نسبت به لرزش مشکل ساز میشود اگر بخواهید مولکولهای بلند DNA را به صورت دست نخورده جداکنیم اگر چه باید از لرزشهای صسورت برای تولید DNA با طول متوسط و مشخثث استفاده کرد توجه کنید که لرزش و صوت هیچ کدام DNA دارد ناتوره نمی کند آنها فقط طول مولکول دو رشته ای DNA را در محلول کوتاه میکنند .
چگالی شناوری : تجزیه و خالص سازی DNA میتواند مطابق با چگالی آن انجا م گیرد در محلولهای با غلظت بالا از نمکی باوزن مولکولی زیاد دارند برای مثال هشت مول کلرید سدیم ، DNA چگالی مشابه با توده محلول معینی حدد 107 گرم دارد اگر محلول در با سرعت بالا سانتریفوژ کینیم ، محلول غلیط سدیم گرایش درد که به انتهای لوله برود و یک شیب چگالی ایجاد کند ( شکل 3) درنهایت DNA موجود در محلول یک نوار معینی را در نزدیک محل رسوب سزیم ایجاد میکند که این نوار به خاطر چگالی شناوری خاص DNA میباشد این روش سانتریفوژ تعادتی براساس شیب چگالی یا سانتریفوژ ایزو پیکینک می گویند از آنجائیکه تحت این وضعیت ذرات RNA در ته ظرف رسوب میکنند این میتواند روش مناسبی برای خالص سازی DNA از این دو ترکیب باشد این روش از نظر تجزیه و تحلیل هم تاثیر دارد زیرا که چگالی شناوری DNA (p) رابطه خطی ای از میزان G+C موجود در مولکول است P=1066+0/098%(G+C) بنابراین رسوب DNA میتواند استفاده شود برای تخمین محتوای G+C و یادر بعضی موارد قطعات DNA با محتوی G+C مختلف از کلروپلاستها مولکول میتواند جداشود .
Q4 : کنترلهای ترجمه و رویدادهای پساز ترجمه نکات کلیدی کنترل ترجمه : در پزوکاریوتها سطح ترجمه سیترونها مختلف میتواند موثر واقع شو بوسیله ( 1) اتصال مولکولهای کوتاه آنتی سنس ( 2) ثبات نسبی با نوکلئازهای قسمتهایی از RNA پلی سیترونی و( 3) باندهای پروتئینی که ممانعت میکنند از دسترسی ریبوزوم تحت تاثیر قرار گیرد در یوکاریتها باندهای پروتئینی میتوانند نیز با پوشش Mrna از ترجمه مانه شوند و تکرار هایی از توالی را بی ثبات کنند و ترجمه Mrna را کمتر کنند .
پلی پروتئینها : یک محصول ترجمه منفرد به نام پلی پروتئین شکافته میشود برای تولید دو یا چند پروتئی جدا بسیاری از ویروسها پلی پروتئینها را تولید میکنند هدف گیری پروتئین : نوالیهای لیپیدی کوتاه ویژه ای در پروتئین تعیین میکند مکان سلولی پروتئین را مانند هسته ، میتوکندری ، یا کلروپلاست توالی نشانه پروتئینخا ترشحی موجب اتثال ریبوزوم در حال ترجمه به عواملی میشود که این عوام در اتصال ریبوزوم به غشا نقش دارند و پروتئین در حال سنتز منتقل میشود از مسان غشاء معمولاً توالی نشانه جدا میشود بوسیله نشانه پپتیدلاز .
تغییر پروتئین : بیشترین تغییرات عادی برای پلی لیپیتدهای جدید جداشدگی و تغییرات شیمیایی هستند شکاف اتفاق می افتد برای انتقال پتیدهای نشانه برای رها سازی قطعات بالغ از پلی پروتئینها برداشت لیپیتدهای داخلی و آرایش پایانه های N و C وجود دارند تغییرات شیمیایی که میتوانند برروی کلی پروتئینها اتفاق می افتد به جزء شش زنجیره جانبی آمینو اسید اغلب فستوریلاسیون فعالیت پروتئین را کنترل میکند تخریب پروتئین : پروتئینها یآسیب دیده تغییر یافته ناپایدار به طور ذاتی با وجود مولکولهای چندتایی یوبی کوئیتین به طور کووالانسی به پرتئینها متصل شده اند برای تخریب مشخص میشوند پروتئین یوبی کوئیتن بعداً تخریب میشود بوسیله یک کمپلکس پروتئاز 26S .
موضوعت مرتبط : ژنهای راه اندازها و افزایش دهنده ها ( m4( پردازش mRNA، hbRNPS و snRNPs کنترل ترجمه : بخا طر ماهیت مختلف mRNA در پروکاریوتها و یوکاریوتها و فقدان پوشش هتسه ای در پروکاریوتها امکانات مختلف وجود دارند برای کنترل ترجمه در پروکاریوتها ساختار تشکیل شده بوسیله نواحی mRNA جایگاههای اتصال ریبوزم را مبهم میکنند بنابراین ترجمه بعضی از سیترونها نسبت به دیگران کاهش می یابد حضور کیپهای چندتایی از معمولاً در ناحیه بدون کلرون ، mRNA را برای تخریب سریع معین میکند نوع دیگری از کنترل ترجمه اتصال مستقیم پروتئینهاا به mRNA و در نتیجه جلوگیری از ترجمه است این RNA ، mRNA پو شیده نام دارد در وضعیتهای مناسب mRNA میتواند با جداشدن پروتئین mRNA میتواند ترجمه شود برخی توالیهای بدون رمز میتواند موجب شود mRNA در قسمت مخصوصی باعث قرار گرفتن آن در سیتوپلاسم شود و قتی ترجمه میتواند شیبی از غلظت پروتئین را در درون سلول ایجاد میکند .
بخا طر ماهیت مختلف mRNA در پروکاریوتها و یوکاریوتها و فقدان پوشش هتسه ای در پروکاریوتها امکانات مختلف وجود دارند برای کنترل ترجمه در پروکاریوتها ساختار تشکیل شده بوسیله نواحی mRNA جایگاههای اتصال ریبوزم را مبهم میکنند بنابراین ترجمه بعضی از سیترونها نسبت به دیگران کاهش می یابد حضور کیپهای چندتایی از معمولاً در ناحیه بدون کلرون ، mRNA را برای تخریب سریع معین میکند نوع دیگری از کنترل ترجمه اتصال مستقیم پروتئینهاا به mRNA و در نتیجه جلوگیری از ترجمه است این RNA ، mRNA پو شیده نام دارد در وضعیتهای مناسب mRNA میتواند با جداشدن پروتئین mRNA میتواند ترجمه شود برخی توالیهای بدون رمز میتواند موجب شود mRNA در قسمت مخصوصی باعث قرار گرفتن آن در سیتوپلاسم شود و قتی ترجمه میتواند شیبی از غلظت پروتئین را در درون سلول ایجاد میکند .
پلی پروتئینها : با کتریوفاژ و نسخه های ویروسی وخیلی از mRNA ها برای هورمونها در یوکاریوتها ترجمه میشوند به صورت زنجیره پلیس پپتیدی که بعد بوسیله پروتئازهای ویژه برای تولید پروتئینهای بالغ چند تایی از یک محصول ترجمه جدا میشوند پلی پپپتید پلی پروتئین نامیده میشود هدف گیری پروتئین : مشخص شده ایت که مکانهایی پروتئین ها در سلول اغلب تعیین میشوند بوسیله آمینو اسیدهای ویژه نسبتاً کوتاه در داخل خود پروتئینها این توالیها میتوانند پاسخگو باشند برای ترشح پروتئینها یا هدف گیری آنها برای اندامک های دیگر هستند پیچیدگی زیاد سلول یوکاریوتی به معنی اینست که انواه مختلفی وجود دارند در هدف گیری یوکاریوتها ترسح پروتئین در پروکاریوتها ویوکاریوت ها با دخالت میکن یک توالی نشانه در پروتئین نوکلئیک پدید و پروتئینهای ویژه صورت میگیرد و شناسایی پروتئین های ویژه با یک ذره RNP ذره شناسایی نشانه SRP انجام میشود .
اگر یک ریبوزوم سیتورولی ترجمه mRNA مربوط به یک پروتئین ترشحی را آغاز کند ، باندهای SRP به ریبوزوم و پلی پپتید خارج شده متصل شده و ترجمه را جلوگیری میکند SRP قادر است ریبوزومها را با یک زنجیره نوکلئیک پدید دارای توالی نشانه شناسایی کند که تشکیل مشود از حدود 13-36 آمینو اسید که دارای حداقل یک آمینو اسید با بار مثبت است که با یک هسته آب گریز تشکبل شده اند 10-15آمینو اسید دنبال میشود و به یک آمینو اسید گوچک خنثی اغلب آلانین متصل است.
شکل 263 دیگر پپتیدهای توالی دارد در پروتئین ها مسئول مکان یابی سلولی آنها هستند توالیهای مختلف پایانه N باعث ورود پروتئین ها به میتوکندری ها یا کلروپلاستها میشوند و توالی داخلی LYS-LYS-LTS-ARG-LYS یا هر پنج آمینو اسید مثبت متوالی میتواند یک نشانه جاگیری هسته ای باشد که باعث ورود پروتئین به درون هسته میشود تغییر پروتئین : یک پلی پپتید تازه ترجمه شده ، همیشه نمیتواند فوراً یک پروتئین کاربردی را تولید کند .
جدا از تاخوردگی صحیح و امکان تشکیل شدن پیوندهای دی سولفید ، وجود دارند تعدادی از تغییرات دیگر برای فعالیت .
این تغییرات شاکل شکافتگی و.
تغییرات کووالانسی مختلف است شکفتگی خیلی معمول است خصوصاً آرایش با آمینو یا کربوکسی پپتیداز ها .
اما انتقال پپتیدهای داخلی در انسولین اتفاق می افتد تغییرات شیمیایی بسیار زیاد و مختلف هستند و دیده شده است که اتفاق میافتد روی پایانه N و C بر روی زنجیره جانبی آمینو اسیدی به جز Val,Met,Leu,IleGly,Ala تغیرات شامل استیلاسیون ،هیدروکسیلاسیون ،فسفریلاسیون ،متیلاسیون ، گلیکوز یلاسیون وحتی افزایش نوکلئو تید میباشند هیدروکسیلاسیون پروتئین در کلاژن رایج است و برخی از پروتئین های هیتونی ، اغلب استیله میشوند فعالیت خیلی از آنزیمها نظیر گلیلوژن فسفریلاز و برخی از عوامل رونویسی یه وسیله فسفریلاسیون کنترل میشوند تخریب پروتئین : پروتئین مختلف نیمه عمرهای بسیار مختلفی دارند پروتئین های تنظیمی به بازسازی دوره ای سریع گرایش دارند و سلولها باید قادر باشند به مصرف پروتئین های ناقص و آسیب دیده در یوکاریوتها مشخص شده است آمینواسیدهای پایانه N ، که نقش بحرانی در پایداری ذاتی پروتئین بازی میکند هشت آمینو اسید پایانه N( val,thr ,ser, pro,met,gly,cys,ala) با پایداری آن پروتئین همبستگی دارد ( ساعت ) هشت آمینو اسید ( tyr, trp,pho,lys,len,his,arg) با کوتاه ( 2 تا 30 دقیقه ) و چهار آمینو ا سید ( glu,gln,asp,asn) به دنبال تغییر شیمیایی ، ناپایدار میشوند پروتئین که آسیب دید تغییر یافته یا پروتئین که بطور ذاتی یک پایانه N آمینو اسیدی ناپایدار است با اتصال کووالانسی مولکولهای کوچک ، پروتئین به شدت حفظ میشود .
یوبی کوئیتن از طریق Gly پایانه C یوبی کوئیتین با آمینو اسیدهای لیزین در پروتئین یوبی کوئیتن دار میشود این پروتئین بوسیله یک کمپلکس پروتئاز 26S هضم میشود دراین واکنش ATP مورد نیاز است و یوبی کوئیتن سالم آزاد میشود برای استفاده مجدد .
E3 : رونوشت برداری چرخه سلولی نکات کلیدی چرخه سلولی DNA فقط نسخه برداری میشود در هنگام فاز S این بوسیله G1 ادامه می یابد و با G2 میتوز بعد از G2 است ورود به فاز S بوسیله چرخه تنظیم میشود و کنیاز پروتئین فرایند منظم است سلولها میتوانند چرخه سلولی GO آغاز کنند .
مراحل چرخه سلولی : چهار مرحله اساسی M,G2,S,GL در چرخه سلولی وجود دارد مرحله S مرحله سنتز DNA است ولی مرحله M یا میتوز مرحله تقسیم سلول است این دو مرحله با G1 و G2 جدا میشوند مرحله M میتواند به چهار مرحله پروفاز ، متافاز ، آنافاز و تلوفاز تقسیم شود G2,S,G1 مرحله انتر فاز را تشکیل میدهند سلولها میتوانند وارد شوند به یک مرحله غیر تقسیم از G1 بنام G0 یا آرامش .
نقاط کنترل و تنظیم آنها : چرخه سلولی در پاسخ به محیط سلول به منظور جلوگیری از تکثیر سلولهای آسیب دیده تنظیم میشود نقاط تنظیمی مراحلی هستند که اگر شرایط برای تقسیم سلولی مناسب نباشد ، چرخه سلولی در آنها متوقف میشود نقاط تنظیم اصلی در انتهای مراحل G1 و G2 اتفاق می افتند .
درنقطه R در مرحله G1 سلولهای بدون متیوژنها از چرخه سلولی خارج و وارد مرحله استراحت G0 میشوند سیکلین ها و کینادهای وابسته به سیکلین : چرخه سلولی از طریق فسفریلاسیون پروتئین ها کنترل میشود که بوسیله کمپلکسهای پروتئین کیناز چند تایی کاتالیز میشوند کمپلکسهای CDK سیکلین مراحل مختلف چرخه سلولی کنترل میکنند فعالیتشان از طریق کنترل رونویسی سنتز آنها تنظیم میشود و تفسیر فعالیت آنزیمی آنها نیز بوسیله پروتئینهای فعال کننده و با تنظیم تخریب آنها تنظیم میگردد نظیم بوسیلهE2F و Rb : پیشرفت G1 بوسیل فعال سازی عامل رونویسی E2F کنترل میشود که این عامل بیان ژنهای لازم را برای مراحل بعدی چرخه سلول را تنظیم میکنند فعال سازی چرخه سلولی آن و مهار آن و سرطانی شدن رده هایی از پروتئین های SIP و INK4 پیشرفت چرخه سلولی را با مهار فعالیت کمپلکسهای CDK سیلیکن متوقف میکنند مراحل چرخه سلولی : از آنجایی فرایندهای تنه سازی DNAو تقسیم سلول در فواصل زمانی مشخص و تنظیم شده و اقع میشوند چرخه سلولی چهار مرحله است : G1 : طولانی ترین مرحله است که سلول برای همانند سازی DNAآماده میشود S : تنها دوره در چرخه سلول در مدتی که DNA همانند سازی میکند .
G2: یک مرحله تاخیری کوتاه قبل از میتوز M : یا میتوز ( جداسازی کروموزمهای خواهری ) و تقسیم سلول G1 ، S و G2 مرحله اینترفاز را تشکیل میدهند میتوز میتواند به مراحل پروفاز مدتی که کروموزمها متراکم میشوند متافاز مدتی که کروماتیدهای خواهری در ناحیه سانترومر متصل شده اند درنهایت آنافاز که در این مرحله کروماتیدهای خواهری جداشده وبه قطبین و ؟؟
کقابل حرکت میکنند و به صورت سلولهای دختر جدا میشوند ر تلوفاز پوشش های هسته ای اطراف کروموزمهای هر قطب را می پوشاند و دوهسته تشکیل میشود نقاط کنترل و تنظیم آنها : شروع یک چرخه تقسیم سلولی به وجود عاملهای رش بیرون سلولی نیازمنداست در فقدان میتوژن ها ، سلولها از چرخه سلول در مرحله G1 خارج و به مرحله استراحت G0 وارد میشوند سلولهایی که بعد از گذشتن از نقطه محدود کننده از میتوژنه محروم مانده اند برای تکمیل تقسیم سلول قبل از ورود به مرحله G0 به چرخه سلولی ادامه میدهند به طور مشخص نقطه محدود کنند از اهمیت محکمی در دوک سلولها برخوردار است برای تحمل یک چرخه تقسیم سلولی G1فاصله ای در میان میتوز و نقطه محدود کننده است .
بخشهایی از چرخه سلولی مانند نقطه محدود کننده که فرایند در آنجا متوقف میشود به عنوان نقاط کنترل مینامند این نقاط در مرحله های تاخیر به کار میروند .
سیکلین ها و کنیاز های وابستهبه سیکلین ها : مکانیزمی ا صلی برای پیشرفت چرخه سلولی تنظیم فسفریلاسیون پروتئین هاست این عمنل بوسیله پروتئین کنیاز های ویژه کنترل میشود که از یک زیر واحد تنظیم کننده و یک زیر واحد کاتالیتک ساخته شده اند زیر واحدهای تنظیم کننده سیکلین ها نام دارند وزیر واحدهای کاتالیتک کنیاز های وابسته به سیکلین ( CDKS) نام دارند سه گروه متفاوت کمپلکس CDK سیکلین وجود دارد که با هر یک از مراحل G1 ، S یا M چرخه سلولی درارتباط هستند کمپلکسهای G1CDK سلول را برای ورود به مساله S با فعال کرد عوامل رونویسی آمناده میکنند عوامل رونویسی موجب رونویسی و بیان آنزیمهای مورد نیاز برای سنتز DNAو ژنهای رمز کننده کمپلکس ه ای CDK مرحله S را موجب میشوند این کمپلکس ها این اطمینان را ایجاد میکنند که هر کرموزوم فقط یک بار رونویسی شود .
فعالیت کمپلکس های CDK در سه مرحله تنظیم میشود : با منترل رونویسی زیر واحدهای کمپلکس CDK با کنترل ممانعت کننده هایی که فعالیت کمپلکسهای CDK را کاهش میدهند با پروتئولیز کردن سازمان یافته کمپلکسهای CDK در مرحله معینی از چرخه سلولی زمانی که این کمپلکسها به مدت طولانی تری نیازمند تنظیم بوسیله E2F و Rb پیشرفت چرخ سلولی از G1 به مرحله S در یک قیمت با فعالیت تنظیم شده رونویسی ژنهاست و.
به نظر میرسد که پیشر فت مراحل بعد چرخه سلول به وسیله مکانیزمهای پس رونویسی تنظیم شود E2F رونویسی وبیان ژنهای رمز کننده پروتئین های مورد نیاز برای همانند سازی DNA وسنتز دی اکسی ریبو نوکلئوتیدها وبرای سیکلین ها و CDK های مورد نیاز در مراحل بعدی چرخه سلولی را تحریک میکند هنگامی که Rb هیپوفسفریله میشود فعالیت E2F ممانعت میشود فسفریلاسیون Rb به وسیله کمپلکسهای CDK سیکلین در طی مرحله میانی و پایانی G1 ، E2F را آزاد میکند که میتواند رونویسی را فعال سازد H1 : طراحی ناقلین پلاسمیری نکات کلیدی محصولات اتصال : یکی از بهترین قدمها در پرورش لکونینگ تشخیص داد بین مولکولهای ناقل تولید شده و پلاسمیدهای نوترکیب است تعدادی از روشها برای تسریع این فرایند توسعه یافته اند.
مقاومت دوتایی بر آنتی بیوتیک : یک ناقل با ژنهای مقاوم آنتی بیوتیک میتوانند برای غربال برای نوترکیبها استفاده شوند اگر قطعه هدف به داخل یکی از ژنها وارد شود بنابراین آن را به طور اتفاقی غیر فعال کند غربالگیری آبی ـ سفید : غیر فعال کردن ژن Lacz روی پلاسمید میتواند برای غربال برای نوترکیبها روی پلات شامل IPTG و ژن X استفاده شود .
ژل x به محلول آبی تبدیل میشود اگر ژن Lacz دست نحورده بوده وبوسیله IPIG القاء شود و ازاین رو نوترکیبها به صورت کلنی های سفید میرویند .
مکانهای کلوئینگ چند تایی : یک مکان کلوئینگ چندتایی انعطاف پذیری در انتخاب یک آنزیم محدود کننده یا آنزیمهای برای کلوئینگ فراهم می آورد .
رونویسی الحاق یافته های کلون شده : یک پروموتور در داخل ناقل ممکن است هم در Invitro و هم در Invivo استفاده شود برای رونویسی یک قطعه وارد شده بعضی از ناقلها دو پروموتور ویژه دارند واجازه میدهند نسخه برداری دو رشته از داخل شده اند.
ناقلهای بیان ژن : خیلی از ناقلها گسترش یافته اند که اجازه میدهند ژنها داخل یک کلون وارد شوند برای بیان بوسیله نسخه برداری از یک پروموتور قوی در ناقل در برخی حالات برای مثال استفاده از ناقلهای بیان ککنده T7 ، یک نسبت بزرگی از کل پروتئین در سلولهای E.cali ممکن است شامل محصولات مطلوب باشد .
موضوعات مرتبط : دست ورزی ژن ـ کتابخانه های ژنی و غربال گری تجزیه و تحلیل و کاربردهای DNA کلون شده .
محصولات اتصال : وقتی که یک قطعه هدف به پلاسمیر حامل انتصال می یاید غالباً باز تولید پلاسمیر حامل با حلقوی شدن قطعه حامل خطی که یک محصول ناخواسته است همراه است حاملین باز اتصال یافته را میتوان با انجام ریز آماده سازیهای از برخی کلنی های تغییر شکل یافته غربالگیری با هضم و الکترومورز با ژن آگار از محصولات نو ترکیب تشخیص داد مقاومت دوتایی به انتی بیوتیک : یک از ناقلهای پلاسمید قدیمی تر که کاربرد زیادی دارد PBR322 است این حامل و مضتق های آن دو تا ژن آنتی بیوتیک مقاوم را داراست amp و teta اگر یک قطعه DNA به منطقه رمزی متصل شود از یک ژن مقاومت ، برای مثال ژن teta ، ژن به طور اتفاق غیر فعال خواهد شد .
در تغییر و تبدیل و مرحله رشد بر روی سطح ظرف کشت تمام کلنی ها ی رشد یافته بر روی یک ظرف کشت دارای آمپی سیلین باید دارای یک پلاسمید باشند با یک ژن سالم amp حاملین باز اتصال شده به تتراسایکلین نیز مقاومت خواهند داشت در حالیکه حاملین که یک قطعه هدف وارد شده در ژن teta را دارنده پروتئین فعال teta را تولید نخواهند کرد و حساس به تتراسایکلین خواهند بود کلنی هایی که بر روی یک ظرف کشت طبیعی آمپی سیلین با استفاده از یک لایه جذب کننده ، منتقل میشود در روی یکظرف کشت ثانویه دارای تتراسایکلین .
کلنی های کشت شده بر روی این ظرف دارای پلاسمید حامل هستند در حالیکه کلنی های که رشئد نمیکنند احتمالاً نوترکیبی هستند کلنی های رشد نیافته از ظرف کشت آمپی سیلین برای تجزیه بیشتر انتخاب میشوند .
غربال گیری آبی ـ سفید یک روش بسیار دقیق برای غربال جهت حضور پلاسمیدهای نو ترکیب که می توانند روی یک ظرف انتقال منفرد انجام شوند غربالگیری آبی ـ سفید نامیده میشوند این روش نیز با غیر فعال شدن یک ژن تداخل یافته صورت میگیرد همانطور که ذکر شده از تولید یک ترکیب آبی به عنوان مصرف استفاده میشود دراین مورد ژن Lacz است که آنزیم بتا گالاکتوزیه از راکد میکند و تحت کنترل پروموتور Lac است .
اگر نژاد E-cali میزبان بیان کننده رپرسور Lac است پس بیان ژن Lac بر روی حامل ممکن است با استفاده از ایزوپروپیل تبادی تیو گالاکتو پیرانوزید ( IPIG) القاء شود آنزیم بیان شده میتواند استفاده شود برای تولید یک محصول آبی و ؟؟
مصنوعی 5 برومو 4 کلرو 3 ایندولیل بتا دی ـ گالا کتوپیرانوزید .
کلنی های سفید بتا گالاکتوزید از بیان نمیکند و از این رو احتمالاً دارای قطعه هدف وارد شده هستند کلنی های آبی احتمالاً دارای حامل باز اتصال یافته هستند این حاملین باید در درون یک نژاد ویژه میزبان تغییر و تبدیل شوند که دارای یک ژن جهش یافته باشند که فقط بخش انتهای سی از بتا گالا کتوزید از بیان کند و بتواند مکمل آلفا پپتید برای تولید آنزیم فعال شود این فرایندهای کاهش میدهد اندازه پلاسمید حمل کننده ژن را اما اساس روش را تغییر نمیدهد .
جایگیرهای کلوئینگ چندتایی : اولین حاملینی که از انتخاب آبی ـ سفید استفاده کردند ایده جایگاه کلونینگ چندتایی بود .این پلاسمید ها ، مجموعه های PUC شامل یک نسخه مهندسی از ژن LACZ هستند که جایگاه های چندتایی آنزیم محدود کننده را در اولین قسمت از منطقه رمز ژن دارد این ناحیه MCS است ورود هدف در این جایگاهها یابین هر جفت ژن Lacz را غیر فعال میسازد و کلنی سفید بر روی ظرف کشت مناسب تولید می کند استفاده ازیک MCS اجازه میدهد انعطاف پذیری را در انتخاب آنزیم محدود کننده یا آنزیمها را برای کلونینگ رونویسی الحاق های کلوک شده : ا زآنجائیکه حاملین بالا یک پروموتور مجاور به ما جایگاه ورود یک قطعه کلون شده دارند تصور ساده این است که چنین راه اندازه بتوانند استفاده شود برای رونویسی DNA داخل شده یا برای تولید یک نسخه RNA در شرایط Inritro که میتواند به عنوان کاوشگر دو رگ گیری یا برای بیان محصول پروتئین یک ژن داخل شده مورد استفاده قرار گیرد چندین نوع از حاملین رونویسی ساخته شده اند ، که اجازه میدهند رونویسی در شرایط Inritro قطعه کلون شده را مثلاً مجموعه های PGEM دارای پروموتورهایی ا ز باکتریوفوژهای T7 و SP6 مجاور یک MCS هستند راه اندازهای فاژ هر یک شناسایی میشوند تنها بوسیله RNA پلیمرازهای باکتریوفاژی مربوطه به خودشان هر یک از این آنزیمها ممکن است در شرایط Inritro برای رونویسی رشته مورد نظر قطعه وارد شده مورد استفاده قرار گیرند ناقلین بیان ژن : ناقلین pus ممکن است استفاده شوند برای بیان ژنهای کلون شده در E-coli این پروسه به وضعیت ومناسب قرار رگفتن قطعه کلون شده در MCS نیاز دارد طوری که منطقه که شده ژن هدف با ژن Lacz مجاور شده و با همان قالب خواندن ژن Lacz خوانده شود انواع بیشماری از ایم گونه های با استفاده ار راه اندازیهای قوی نظیر Lacur-5 راها نئاز فاژ xpl یا راه انداز فاژ t7 توسعه یافته است بعضی از ناقلها به تهیه یک جایگاه اتصال ریبوزوم و ترجمه رمز اغازین در قطعه کلون شده متکی هستند در حالیکه برخی برای رمز کردن یک توالی همجوش شده در انتهای N پروتئین بیان شده طراحی شده اند که امکان خالص سازی پروتئین را با یک مرحله اتصال ویژه به راحتی فراهم میکند مثالی از این ناقلین His – Tag است که مجموعه ای از آمینو اسیدهای هستید است که بطور محکمی به ستون کروماتوگرافی حامل یونهای Ni2+ متصل خواهد شد برخی ناقلین ممکن است حتی اجازه دهند برداشت انتهای به آمیخته شده از پروتئین راب ا شکافتگی بوسیله یک پروتئاز ویژه امکانپذیر شود .
یک مثال برای کاربرد موضوع توضیح داده میشود بیان قوی بسیاری از پروتئین ها در E-coli با استفاده از سیستم راه انداز T7 انجام میشود ناقل دارای یک راه انداز T7 ویک RBS اشریشیا کلی است که با بک رمز شروع ، یک mcs و درنهایت یک پایان دهنده رونویسی دنبال میشود بیان در یک نژاد ویژه E-coli انجام میشود که RNA پلیمراز T7 را درالقاء با IPIG تولید میکند آنزیم قبلی کارآمد است و تنها از راه انداز T7 رونویسی میکند و در نمونه های مطلوب در تولید پروتئین هئدف بیش از 35% از کل پروتئین E-coli نقش دارد .
J3 : واکنش زنجیره ای پلیمراز نکات کلیدی PCR : واکنش زنجیره ای پلیمراز اسنتفاده میشود برای تکثیر توالی DNA با استفاده از یک جفت پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی ، که هر یک یرایمر ها با یک انتهای توالی DNA هدف کامل کننده همدیگر هستند اینها گسترش باقته اند به سمت همدیگر بوسیله DNA پلیمراز مقاوم در چرخه واکنش این سه مرحله 1.
واسرشت شدن 2 اتصال پرایمر 3.
پلیمریزاسیون چرخه PCR : چرخه واکنش متشکل از مراحل زیر است مرحله ای با دمای 95 درجه سانتیگراد برای دناتوره کردن DNA دوتایی مرحله اتصال در دمای حدود 55 درجه سانتیگراد که باعث میشود آغاز گرها اتصال یابد و مرلحله پلیمریزاسیون که در دمای 72 درجه سانتیگراد است Mg2+ و 5ntps بجز DNA الگو آغاز گر بافر و آنزیم مورد نیازند .
الگو : تقریباً هر منبعی که شامل یکی یا بیشتر DNA هدف دست نخورده باشد میتواند از نظر تئوری بوسیله PCR تکثیر یابد به شرطی که آغاز گرهای اختصاص برای آن طراحی شود .
آغاز گرها : یک جفت از الیگو نوکلوئوتیدها حدود 30-18 نوکلئوتید با مقدار مشابه C+G به عنوان آغاز گرهای PCR به کارگرفته میشوند پرایمر ها ساخت DNA بر طرف یکدیگر در دو جهت مقابل هدایت میکنند پرایمر با کمی انحطاط میتوانند مورد استفاده قرار گیرند .
آنزیم ها : DNA پلیمرازهای مقاوم بر حرارت در PCR استفاده میشود طوریکه این آنزیمها در مرحله واسرشت شدن با حرارت بالا تخریب نمیشوند بهینه سازی PCR : آن ضروری است که دمای اتصال تغییر یابد و یا غلظت Mg2+ برای اینکه تکثیر صحیحی انجام شود لازم باشد استفاده از مخلوطهای پیچیده جفت دوم آغاز گرهای دو مرحله ای به طور ویژه ای موجب اصلاح میشوند .
موضوعات مرتبط : DNA کلونینگ مرور کلی نشان ویژه سازی کلونها کتابخانه های ژنومی کاربردهای کلونینگ روش های غربالگری PCR : اگر یک جفت پرایمر الیگ.
نوکلوتید بتواند طراحی شود تا با یک مولکول DNA هدف مکمل باشد طوری که آنها بوسیله DNA پلیمراز به طرف یکدیگر پیش بروند سپس منطقه الگو بوسیله پرایمر باند شود وبا انجام چرخه های واسرشت شدن ، اتصال پرایمر و پلیمریزاسیون به حد زیادی تکثیر شود این فرایند بعنوان PCR شناخته میشود آن یک ابزار ضروری در بیولوژی مولکولی شده است وبرای کلون کردن و تجزیه و تحلیل ژن مورد استفاده قرار گیرد کشف DNA پلیمرازهای مقاوم بر حرارت مراحل را در چرخه PCR آسان کرده است کاربردهای آن در بسیاری از مراحل علم مشخص شده است .