دانلود تحقیق روش های ورود DNA یه درون سلول

روش های ورود DNA یه درون سلول ورود DNA خارجی به سلول و بقای آن، پایه و اساس بیو تکنولوژی است.

«تراژن» موجودی است که DNA خارجی دارد.

روش های تغییر ژنتیکی، باکتری ها، قارچ ها، جانوران و گیاهان تراژنی را تولید می کنند که در تحقیقات پایه از آن ها استفاده می شود و کاربردهای عملی نیز دارند.

در این مختصر سعی بر این است، روش های ورود DNA به سلول، شامل الکتروپوریشن (منفذ زایی الکتریکی) ، بیولیستیک (تفنگ الکترونی)، میکرواینجکشن (ریز تزریق) و DNA – T اگر باکتریوم و کاربردهای آن ها شرح داده شوند.

تغییر ژنتیکی باکتری تعدادی از گونه های باکتری به طور طبیعی توانایی جذب DNA را دارند.

این توانایی شایستگی طبیعی نامیده می شود که قابل افزایش است.

مثلا گونه ای از استرپتوکوکوس ها قابلیت تغییر دارند و زمانی که غلظت سلول ها به حد معینی برسد، این قابلیت، افزایش می یابد.

و یا هموفیلوس آنفلونزا زمانی که در شرایط گرسنگی قرار می گیرد، می تو.اند DNA را جذب کند.

گونه هایی از سیانوباکترها نیز وجود دارند که در هر مرحله از چرخه رشدشان، می توانند DNA را جذب کنند.

برای ساختن گونه های تغییر یافته، از تیمارهای مصنوعی استفاده می شود.

سلول ها به صورتی آماده می شوند که توانایی جذب DNA را به دست آورند.

البته اغلب این دستکاری ها، طول عمر باکتری ها را کاهش می دهند، اما سلول های باکتریایی که زنده می مانند، بهتر میتوانند DNA را جذب کنند.

تغییر ژنتیکی اشریشیاکلی با پلاسمید نو ترکیب، روش مهمی در کلون سازی DNA نوترکیب است.

برای ایجاد تغییر ژنتیکی در E.coli ، وسوسپانسیونی از باکتری در محلولی از کلرید کلسیم 1/0 مولار وارد می شود و روی یخ قرار می گیرد.

پس از آن،ظرف حاوی باکتری به محیط o 42 منتقل می شود.

در شرایط کلی 7 10×5 تا 8 10 DNA پلاسمید تغییر یافته، به ازای هر میکروگرم پلاسمید به دست می آید.

کلرید کلسیم سرد تغییراتی در غشا ایجاد می کند .

طی این تغییرات، DNA بهتر به غشا متصل می شود و در شوک حرارتی o 42 ، با مکانیسمی نا معلوم وارد سلول می شود.

در حال حاضر، با اصلاح روش های موجود، بیش تر از 9 10 پلاسمید تغییر یافته به ازای هر میکروگرم پلاسید، DNA تولید می شود.

DNA ، پس از ورود، برای بقا در سلول ، باید وارد ژنوم سلول و جزئی از آن شود .

یا به درون DNA پلاسمیدی که قادر است تکثیر کند، رود و با آن شروع به تکثیر کند.

یا آن که در سلول میزبان حمایت شود و باقی بماند.

منفذزایی الکتریکی (ایجاد منفذ در باکتری به وسیلۀ الکتریسیته) در منفذزایی الکتریکی، سلول های باکتری در محلولی از DNA وارد شده، در معرض میدان الکتریکی با ولتاژ بالا قرار می گیرند.

ولتاژ بالا سوراخ های کوچکی در غشای لیپدی سلول ایجاد می کند و در نتیجه، مولکول های کوچک و ماکرومولکول ها می توانند از این طریق وارد سلول و یا از آن خارج شوند.

این سوراخ های به وجود آمده در برخی از سلول ها، خود به خود بسته می شوند.

ولتاژی که در منفذ زایی الکتریکی به کار می رود، حدود 50 درصد سلول ها را می کشد .

تعدادی از سلول ها نیز به علت بسته نشدن سوراخ ها می میرند.

بنابراین سلول هایی که زنده مانده اند، احتمالا تغییر یافته اند.

این روش، تغییر ژنتیکی را در تعدادی از گونه های باکتری آسان کرده است و در برخی گونه ها برای اولین بار، امکان تغییر را مهیا ساخته است.

در روش معمول منفذ زایی الکتریکی، سلول های باکتری در آب یا بافری با چگالی 1010× 5-1 سلول در هر میلی لیتر (ml) وارد می شوند.

در قسمت خاصی از بازار منفذزایی (شکل 1) 200 میکرولیتر از سلول ها با یک نانو گرم تا یک یکروگرم از DNA پلاسمیدی مخلوط می شود و روی یخ قرار می گیرد.

ولتاژ بالای الکتریکی برقرار می گردد.میدان الکتریکی معمولی برای منفذزایی الکتریکی باکتری ها از 20 تا 25 کیلو وات بر سانتی متر (KV/cm) متغیر است.

مایع ویژه ای برای رشد سلول ها افزوده شده و آن ها بین یک تا دو ساعت در گرمخانه قرار می گیرند.

این کار، برای بیان ژن مقاومت به آنتی بیوتیک که قبلا در DNA پلاسمید وارد شده است، صورت می گیرد.

این ژن علامت مشخص ژنتیکی است.

سپس باکتری ها روی محیط جامد آگار که دارای آنتی بیوتیک مناسب است، کشت داده می شوند.

باکتری هایی که تغییر یافته اند، و ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را کسب کرده اند، زنده مانده و رشد می کنند.

باکتری های تغییر نیافته، در اثر آنتی بیوتیک محیط از بین می روند.

با استفاده از روشمنفذ زایی الکتریکی، 10 10 DNA تغییر یافته، به ازای هر میکروگرم از DNA پلاسمیدی برای گونه های معینی از coli.E مشاهده شده است.

انتقال ژنتیکی سلول های یوکاریوتی منفذ زایی الکتریکی یوکاریوت ها منفذ زایی الکتریکی برای تغییر ژنتیکی سلول های جانوری شامل: فیبروبلاست ها، لنفوسیت ها، سلول های عصبی، سلول های اندوکرین، سلول های اولیه جانوری، سلول های کبدی و سلول های پایه خونساز به کار می رود.

میزان فراوانی سلول های تغییر یافته از یک سلول در 10 10 تا 1010 سلول متفاوت است و به نوع سلول متفاوت است و به نوع سلول و غلظت DNA خارجی بستگی دارد منفذ زایی الکتریکی همچنین برای ورود DNA به پروتوپلاست گیاهی (سلول خهای فاقد دیواره) به کار می رود.

بدین منظور، دیواره سلول های گیاهی با آنزیم هضم و حذف می شود.

دیکیسر و همکارانش، در سال 1990 برای بررسی بیان ژن به روش فوق، DNA را به بافت سالم و نمو یافته گیاهان برنج گندم ، ذرت و جو وارد کردند.

مطالعات آن ها نشان داد، بیان گذرایی از ژن ها القا می شود.

زیرا که پروتوپلاست ها، از نظر فیزیولوژیکی، با سلول هایی که از آن ها مشتق شده بودند فرق داشتند.

مطالعات بعدی نشان داد، استفاده از قطعاتی از گیاهان به جای پروتوپلاست پاسخ بهتری خواهد داد.

لذا محققان برای تغییر ژنتیکی بافت های سالم گیاهی به روش منفذزایی الکتریکی زمیان گرمخانه گدازی DNA با بافت را قبل ازپالس الکتریکی اضافه کردند و پالس طولانی تری نیز به کار بردند.

دو اتفاق ممکن است رخ داده باشد: 1- پالس الکتریکی توانسته است هم در دیواره سلولی و هم در غشای سلولی گیاه شکاف هایی ایجاد کنند.

2- DNA به طور غیر فعال از میان سوراخ هایی که به طور طبیعی در دیواره سلولی ایجاد شده اند، عبور کرده و پالس الکتریکی فقط غشای سلولی را باز کرده است.

ریز تزریق یوکاریوت ها ریز تزریق روش دیگری برای وارد کردن DNA به درون سلول های یوکاریوت است.

در روش معمول، از سلول های تخمک بارور شده موش استفاده می شود.

DNA خارجی با استفاده از میکروسکوپ و دستگاهی به نام میکرومانیپولاتور وارد می شود لوله باریکی که مختصری خلا دارد، کنار سلول تخمک آورده می شود و به علت خلا موجود، سلول به لوله چسبیده و بدین طریقسلول در جای خود ثابت می شود.

سپس با یک سوزن خیلی باریک که قطر خارجی آن یک میکرومتر است، DNA خارجی به سلول تزریق می شود.

تقریبا در هر تزریق دو پیکولیتر از DNA با غلظت یک نانوگرم بر میکرو لیتر وارد می شود.

اگر حجم خیلی زیادی از ان تزریق شود، هسته ها متلاشی می شوند.

تخمک های بارور شده، پس از وارد شدن DNA خارجی به درون آن ها، در رحم مادرهای پرورش دهنده، کاشت می شوند.

پس از تولد موش ها، بخشی از دم آن ها بریده و DNA ژنومی از بافت آن ها استخراج می شود و با روش دور گه سازی DNA وجود DNA خارجی مورد بررسی قرار می گیرد(شکل 2) وجود DNA خارجی در موش تراژن باید به طور کامل مشخص شود زیرا DNA تزریق شده ممکن است، در چندین کپی پشت سر هم تنها در یک مکان وارد شود و یا جداگانه و مستقل در دو مکان یا بیش تر قرار گیرد و در جای مطلوب خود وارد نشود.

تغییر بیوبیستیک یوکاریون ها بیو لیستیک از دو کلمه بیولوژیکال به معنی زیست شناسی و بالیستیک به مفهوم پرتابه شناسی مشتق شده است و ابزاری برای تغییر ژنتیکی گیاهان، جانوران اندامک ها، میکروب های یوکاریوتی و پروکاریوت هاست.

این روش در واقع نوعس شلیک DNA به درون سلول است.

سنفورد و همکارانش در سال 1987 اولین تغیر ژنتیکی را به این روش انجام دادند.

در این روش، DNA به ذرات کوچک تنگستن متصل شده، سپس با سرعت زیاد به وسیله تفنگی مخصوص به طرف سلول های هدف پرتاب می شودو مولکول های DNA می تواند روی ذرات کوچک تنگستن با قطر 5/0 تا 5 میکرومتر یا روی ذرات طلا قرار گیرند.

مخلوطی از ذرات، درون بخشی از ابزار ویژه این روش، به نام ماکروپروجکتایل قرار داده شد و با سرعت زیاد به سمت هدف شلیک میشود.

این وسیله بخشی شبیه سیلندر دارد که پیستون داخل آن قرار می گیرد.

در نوع اولیه آن، از فشنگ به عنوان ماکروپروجکتایل و از گوگرد برای شتاب دادن به آن استفاده می شدو صفحه متوقف کننده ای نیز تعبیه شده بود که مانع عبور پروجکتایل ها می شد، در حالی که ذرات می توانستند از سوراخ های کوچک موجود در صفحه عبور و به بافت هدف اصابت کنند.

بافت هدف نیز در خلا قرار داده می شد.

اما در نوع پیشرفته آن از یم میدان الکتریکی با گاز فشرده برای شتاب دادن به ماکروپروجکتایل استفاده می شود.

در بازار بیوبیستیک هلیمی از گاز هلیم با فشار بالا استفاده می شود که شتاب دهنده ماکروپروجکتایل هاست.

ماکروپروجکتایل صفحه نازک دو میلی متری است و میکروپروجکتایل هایی دارد که DNA روی آن ها چسبانده می شود.

صفحه متوقف کننده نیز خیلی نزدیک به هدف قرار می گیرد که در این صورت به خلا نیاز نیست.

در این روش 95 درصد سلولهای بافت هدف زنده می مانند، اما آزمایش بر روی سلول های پوست، کبد و رودۀ موش نشان دادند، تغییرات گذرا هستند و به مدت طولانی ثابت نمی مانند.

حامل های اگروباکتریوم برای گیاهان از باکتری بیماری زای گیاهی اگروباکتریوم توکه فاسینس برای تغییر ژنتیکی موثر در تعدادی از گونه های گیاهی استفاده می شود.

این باکتری پلاسمید Ti 120 یا االقا کنندۀ تومور نامیده می شود.

بخشی از این پلاسمید DNA-T13 نام دارد که از پلاسمید جدا و به سلول گیاه آلوده شده منتقل می شود و در واقع جزیی از ژنوم هسته ای گیاه می شود.

ژن های بخش DNA- T هورمون هایی را درگیاهان بیان می کنند که تولید بالای آن ها، تقسیم سلول های گیاهی را تحریک و در پی آن تاول تاجی تولید می کنند.

ژن های بیماری زا که روی پلاسمید Ti قرار دارند، برای انتقال DNA- T ضروری هستند، اما خود آنها انتقال نمی یابند.

توالی 25 جفت بازی در هر دو انتهای DNA- T وجود دارد.

که DNA- T مرزی نامیده می شود.

DNA خارجی بین DNA های مرزی قرار می گیرد و به درون هسته گیاه وارد می شود.

هنگامی که از پلاسمید Ti به عنوان حاملی برای ورود DNA به درون گیاهان استفاده می شود، ژن های تولید کننده تومور حذف می شوند.

(شکل 4) برای غربال گری از ژن هایی مانند ژن مقاومت در برابر آنتی بیوتیک ها استفاده می شود.

این ژن، ویژگی قابل تشخیصی به سلول های نوترکیب می دهد که از سلول های غیر نوترکیب تشخیص داده می شوند.

سایر روش های انتقال ژنتیکی از سایر روش های انتقال ژنتیکی می توان به روشی اشاره کرد که در سال 1988 ، برای ورود DNA به درون سلول ها به کار رفت.

با این روش DNA خارجی تحت تیمار فسفات کلسیم قرار می گیرد و به این ترتیب مقدار زیادی از DNA جذب و به درون سلول ها وارد میشود.

روش دیگر، استفاده ا ز ویروس هایی مانند رترویروس هاست که قادرند سلول ها رابا کارایی بالا آلوده کنند و ژن های مطلوبی را به درون سلول ها وارد سازند.

رترویروس ها ، ویروس های RNA داری هستند که با استفاده از آنزیم نسخه برداری معکوس، DNA دو رشته ی می سازند.

این DNA وارد ژنوم میزبان می شود.

در آن باقی می ماند و با نسخه برداری از آن، RNA بیش تری به دست می ماند و با نسخه برداری از آن، RNA بیش تری به دست می آید.

ژن های مورد نظر، در ژنوم رتروویروس جاسازی و به درون سلول وارد شده و جزئی از ژنوم میزبان می شوند.

استفاده از ترانسپوزون ها روشی دیگر برای انتقال ژنتیکیاست.

ترانسپوزون ها عناصر ژنتیکی متحرکی هستند که به عنوان حامل بر ای انتقال ژن به کار می روند.

تعداد دیگری از روش های خیلی ساده نیز می توانند سلول ها را تغییر دهند.

مثلا اگر جلبک کلامیدوموناس که فاقد دیواره سلولی است، با ذرات شیشه ای و محلولی از DNA تحریک شود، تغییر ژنتیکی می یابد و یا با امواج فراصوتی می توان DNA خارجی را وارد سلول های گیاه تنباکو کرد.

کاربردهای سلول ها و جانوران تراژن هزاران کاربرد برای جانداران و سلول ها تراژن وجود دارد.

از جانداران تراژن برای مطالعه تنظیم بیان ژن استفاده می شود.

اهمیت توالی های DNA در تنظیم ژن، با حذف یا جهش در بخشی از ان ها مورد بررسی قرار می گیردو با انتقال DNA به درون جاندار، اثر جهش روی بیان ژن فیزیولوزی و نمو جاندار مطالاعه می شود.

چنین مطالعاتی وجود توالی هایی به نام تقویت کنندگان نسخه برداری را نشان داد.

این توالی ها بیان ژن را افزایش می دهند و توالی های مهم برای بیان ژن ویژه بافت و ویژه نمو را نشخص می کنند.

در واقع این توالی ها ژن هایی را که در هر بافت یا در هر مرحله از رشد سلول موثر و مفیدند خاموش و روشن می کنند.

جانداران تراژن ویژگی های تغیر یافته مفیدی دارند.

برای مثال ژن های مقاوم به حشرات و علف کش ها وارد گیاهان شده اند و گیاهان مقاومیتولید شده اند.

از موش های تراژن برای بررسی ویژگی نمو و بیان ژن ویژه بافت و همین طور مطالعه نمو سیستم مدلی رابرای مطالعه بیماری های ژنتیکی انسان و سرطان ها تهیه کرد.

پیشرفت تکنیک های فوق ژن درمانی انسان را نیز هموار ساخته است.

در ژن درمانی، کپی سالم و عملگری از ژن ناقص وارد ژنوم می شود.

این کپی سالم قارد است، نقص ژنتیکی موجود در سلول را مرتفع سازد.

اخیرا در آزمایش های کلینیکی برای درمان بیماران دچار کمبود ژن آدنوزین د آمیناز (ADA) لنفوسیت های T تقسیم کننده آنان با حامل رترویروسی که دارای ژن سالم ADA و یک علامت ژنتیکی است، در گرمخانه قرار داده و چند روز رشد داده می شود.

سپس سلولهای دارای ژن سالم به بدن بیمار بازگردانده می شوند این سلول ها قادرند ADA سالم و بدون نقصی تولید کنند.

یکی دیگر از کاربردهای موش های تراژن تهیه داروهای تراژن است.

داروهای تراژن داروسازی مولکولی کاربرد جالبی از روش های تغییر و دگرگونی ژنی است.

در داروسازی مولکولی پروتئین های انسانی در شیر حیوانات اهلی تراژن تولید می شوند و به عنوان دارو به کار می روند.

Bialy در سال 1991 تولید موفقیت آمیز پروتئین های دارویی را در گوسفندان، بزها و گاوها گزارش کرد.

استفاده از حیوانات تراژن در تولید این نوع از پروتئین ها فایده های بالقوه بسیاری دارد در این روش محصول زیادی حدود ده ها گرم پروتئین درهر لیتر شیشر به دست می آید.

گاوها حیوانات ایده آلی برای دارو سازی مولکولی به شمار می روند.

آن ها قادرند، در حدود 10 هزار لیتر شیر در سال تولید کنند.

برخی پروتئین ها بعد از نسخه برداری دستخوش تغییراتی می شوند مانند اضافه شدن قند که گلیکولیزاسیون نام دارد این عمل برای فعالیت تعدادی از پروتئین ها ضروری است و غالبا این تغییرات، طول عمر پروتئین ها را نیز در جریان خون بیماران افزایش می دهند.

رایت و همکارانش در سال 1991 کلون سازی و بیان موفق ژن آلفا – 1- تریپسین را در گوسفند گزارش کردند آلفا -1 – آنتی تریپسین گلیکو پروتئین سرم است که نقص ژنتیکی در ژن آن سبب آمفیزم می شود.

آمفیزم از دست رفتن قابلیت ارتجاعی شش هاست.

اخیرا این پروتئین از پلاسما نیز جدا شده است اما تولید آن در حیوانات ارزان تر است و می تواند بازده بیش تری داشته باشد.

برای تولید گوسفند تراژن تخمک ها به طور مصنوعی باردار شدند.

سپس ژن آلفا -1- آنتی تریپسین به درون تخم ها ریزتزریق شد.

در ادامه، تخم های دارای ژن جدید به درون رحم مادرهای پرورش دهنده وارد شدند.

برخی از تخم ها کپی سالمی از ژن های خارجی دا داشتند مطالعات مقادیر کمی از آلفا -1- آنتی تریپسین را در شیر برخی میش ها تایید کرد.

اما در یک مورد 35 گرم پروتئین در هر لیتر شیر به دست آمد.

در همان سال دنمن و ابرت همراه با همکارانش موفق شدند، با این روش پروتئین فعال کننده پلاسمینوژن بافتی را در بزها تولید کنند.

tpa پروتئین قند داری است که لخته های فیبرین را متلاشی می سازد.

لخته های فیبرینی انفارکتوس ماهیچه قلب و انسداد شش ها را سبب می شوند.

مقایسه روش ها تغییرات بیولیستیکی می توانند خیلی موثر باشند.

اما این روش، تخریب قابل ملاحظه ای رد بافت نشان می دهد.

درم قابل ابزاری که با فشار گاز هلیم کار می کندتخریب کم تری دارد.

در روش منفذ زایی الکتریکی غلظت DNA می تواند تنظیم شود.

تنظیم غلظت DNA برای به دست آوردن مقدار بالای تنها یک کپی از ژن در یک منطقه ایده آل انجام می شود.

این روش برای تغییر مقداری از سلول ها به طور همزمان نیز مفید است.

ریز تزریق برای تغییر یک سلول به کار می رود و روش خیلی پیشرفته آزمایشگاهی است که به ابزار ویزه نیاز دارد با این روش همچنین می توان یک ژن را در چند جا وارد کرد.

برای گیاهانی که می توانند با اگروباکترویوم تومه فاسینس آلوده شوند، وکتور DNA- T موثر و کاراست این روش ها سلول ها و جانداران تغییر بافته ای را برای مطالعه بیان ژن تواید می کنند همچنین سیستم مدلی از بیماری های انسانی را فراهم ساخته و برای تولید محصولات مفید به کار می رود.

امروزه کاربرد این روش ها به سرعت در حال افزایش است.