چکیده
به منظور بررسی اثرات استفاده از لجن فاضلاب و سایر مواد زائد شهری و کشاورزی بر آلودگیهای میکروبی خاک ، چهار نوع کود آلی شامل لجن فاضلاب ، کود حیوانی ، کمپوست زباله و مخلوط کاه گندم و یونجه در آزمایشات گلخانه ای در قالب طرح های کاملا تصادفی مورد ارزیابی قرار گرفتند. بررسی تغییرات جمعیت میکروبی مخلوط کودهای فوق با خاک شامل باکتریها ، قارچها و آکتینومایستها بررسی تغییرات جمعیت کلیفرمها و شناسایی تعدادی از آنها و همچنین شناسایی انواع میکرو فلور غالب در تیمارهای مختلف به روش اسلاید پنهان ، از اهداف اختصاصی در تحقیق فوق بوده است. بیشترین جمعیت باکتریها و قارچها در کودهای کمپوست زباله و لجن فاضلاب و بیشترین جمعیت آکتینومایست ها در کاه گندم مشاهده شد. شمارش کلیفرمها نشان داد که در هفته اول انکوباسیون ، جمعیت کلیفرمها بخصوص در کود حیوانی بسیار زیاد است. در این مدت وجود بعضی از باکتریهای کلیفرم در کودهای لجن فاضلاب ، حیوانی و کمپوست زباله تشخیص داده شد. همچنین در این تحقیق ، تکنیک اسلاید پنهان به عنوان یکی از بهترین روشهای بررسی تنوع اکولوژیکی موجودات ذره بینی خاک معرفی شده است.
کلمات کلیدی: لجن فاضلاب ، خاک، محیط زیست ، میکروارگانیسم ها
مقدمه
خاک می تواند موجب انتقال عوامل بیماریزای بسیاری از امراض عفونی گردد(11) . تعداد میکروبهایی که از طریق فضولات به خاک اضافه می شوند ، به وسعت آلودگی های خاک می افزایند. بررسی خصوصیات فیزیکی و شیمیایی مواد زائد یا به عبارتی کودهای آلی ، مدتهاست که به منظور بهینه سازی و استفاده آگاهانه از آنها صورت می پذیرد(9)در این میان خصوصیات بیولوژیکی کودهای آلی در مطالعات فوق نادیده گرفته می شود و توصیه به استفاده از کودهای آلی بدون بررسیهای همه جانبه بیولوژی و زیست محیطی آنها صورت می گیرد. از آنجایی که خاک پایگاه موجودات خشکی زی بویژه جوامع انسانی است و انتقال عوامل پاتوژن از راههای گوناگون توسط گرد و غبار از راه تنفس و زخمهای سطحی بدن به انسان و حیوان صورت می گیرد ، بنابراین خصوصیات بیولوژیکی و جمعیت فلور میکروبی بیماریزای خاک را باید تعیین نمود. کلیفرمها که از باکتریهای خانواده انتروباکتریاسه هستند ، معمولا به عنوان شاخص آلودگی آب و خاک مورد ارزیابی قرار می گیرند(8). خانواده انتروباکتریاسه شامل گروه بزرگی از باکتریها می باشد که بطور وسیع در طبیعت پراکنده هستند. این باکتریها در روده انسان ، حیوانات ، در خاک و آب وجود دارند که به دلیل زندگی آنها در روده انسان و حیوانات به باسیلهای انتریک معروفند. همه این باکتریها هوازی و بی هوازی اختیاری ، گرم منفی ، بدون اسپور و میله ای شکل ، دارای متابولیسم تنفسی و تخمیری ، دارای قدرت تخمیر گلوکز و لاکتوز هستند. علاوه بر تولید بیماریهای مختلف ، از انجایی که این باکتریها ساکن طبیعی دستگاه گوارش می باشند ، به محض وارد شدن به هر نقطه از بدن ، می توانند در تمام بافتها و اعضاء ایجاد عفونت کنند (5). در شهر اصفهان به دلیل وجود کارخانه تولید کود آلی کمپوست و چند تصفیه خانه فاضلاب ، هر ساله مقادیر زیادی کمپوست زباله و لجن فاضلاب در زمینهای کشاورزی مصرف می شود و چون مصرف این کودها بدون نظارتهای بیولوژیکی صورت می گیرد ، لذا می تواند تاثیر نا مطلوبی را در محیط زیست بگذارد. تحقیق حاضر نیز در راستای ارزیابی آلودگیهای میکروبی خاکهای کشاورزی که با استفاده از انواع مواد زائد و فضولات تیمار میشوند ، صورت پذیرفت.
مواد و روشها
در این تحقیق چهار نوع کود آلی شامل لجن فاضلاب ، کود حیوانی ، کمپوست زباله و مخلوط کاه گندم و یونجه ، به عنوان چهار تیمار اصلی ( به میزان دو درصد وزنی ) به همراه شاهد بدون کود در سه تکرار در یک طرح آماری کاملا تصادفی در آزمایشات گلخانه ای ارزیابی شدند. این آزمایشات بطور کلی در سه بخش شامل تعیین جمعیت باکتریها ، قارچها و اکتینومایست ها در خاک ، بررسی میزان آلودگی خاک به کلیفرمها و شناسایی انواع میکروفلور غالب در تیمارهای مختلف به روش اسلاید پنهان انجام پذیرفت. برای تعیین جمعیت میکروبی خاک ، ابتدا از نمونه خاک در تیمارهای مختلف ، سوسپانسیون و سپس سری رقت تهیه شده و به منظور پراکنده شدن خاکدانه ها و جداشدن میکروارگانیسمها از ذرات خاک ، از ارتعاشات اولتراسونیک استفاده شد. پس از تهیه سری رقت ، از محیط کشت نوترینت آگار برای کشت باکتریها ، از محیط کشت +PDA کلرامفنیکل برای کشت قارچ و از محیط کشت جنسون آگار به منظور کشت اکتینومایست ها استفاده شد. پس از طی زمان انکوباسیون ، تمام کلنی ها بر روی محیط کشت مورد نظر توسط کلنی کانتر کوبک شمارش گردید. برای مطالعه کلیفرمها از روش تخمیر چند لوله ای در محیط کشت لاکتوز برات و EMB و تست های فرضی و تأییدی و IMVic استفاده شده و نتایج به صورت MpN گزارش گردید(2و8) . برای مشاهده میکروارگانیسم ها به روش اسلاید پنهان ، محیط کشت مورد نظر را به طریقه استریل تهیه کرده و لایه نازکی از آن را روی لام شیشه ای قرار می دهیم. سپس لام مغذی را درون پلیت حاوی خاک در تیمارهای مورد نظر قرار داده پس از 7-4 روز انکوباسیون در دمای 30 درجه سانتی گراد ، لام را از خاک در آورده ، پس از شستشو و حرارت دادن به منظور فیکسه کردن ، لام را با استفاده از رنگ آمیزی گرم ، رنگ کرده و با بزرگنماییهای مختلف توسط میکروسکپ مشاهده و عکسبرداری می شود.
نتایج و بحث
در میان تیمارهای مورد استفاده ، بیشترین جمعیت باکتریها و قارچها در کودهای کمپوست زباله و لجن فاضلاب مشاهده شد ، نتایج تجزیه واریانس نیز معنی دار بودن اثر زمان نگهداری و تیمار کودی را بر تعداد جمعیت باکتریها و قارچها نشان می دهند. شاید بتوان مهمترین علت افزایش جمعیت باکتریها در لجن فاضلاب را نسبت C/N پائین این کود دانست این نسبت باعث می شود شرایط تجزیه مواد آلی برای یورش میکروبی مساعد شده و باکتریها که عمدتا بر روی مواد با C/N کم فعالیت بیشتری دارند ، در مدت کوتاهی رشد و تکثیر یابند(10). در مورد افزایش جمعیت باکتریها در کود کمپوست می توان به چند دلیل اشاره کرد. اول اینکه بسیاری از محققین معتقدند وجود مواد مغذی و احتمالا بعضی از کاتالیزورهای حیاتی در کمپوست زباله می تواند رشد باکتریها را تشدید کند (3). همچنین جمعیت بالای ازتوباکترهای تثبیت کننده ازت در این کود می تواند نوعی منبع دائمی ازت را برای رشد باکتریها فراهم کرده و اثر C/N بالای این کود را تا حدی برطرف نماید. در این راستا ، نتایج آزمایشات مختلف نشان داده است که باکتریهای تجزیه کننده سلولز ، به دلیل نیاز شدیدی که به ازت دارند ، در مجاورت باکتریهای تثبیت کننده ازت خیلی بهتر رشد می کنند(4) . افزودن مواد آلی قابل تجزیه در تیمارهای مختلف باعث شد که قارچهای خاک از حالت فونجیستاسیس و رکود خارج شده و رشد فعال خود را از سر بگیرند (6). نتایج نشان می دهد که جنسهای پنیسیلیوم ، آسپرژیلوس ، آلترناریا و فوزاریوم که جزء قارچهای ناقص محسوب می شوند ، درصد بالایی از قارچهای خاک را تشکیل می دهند. همچنین علاوه بر قارچهای فوق ، در تیمار لجن فاظلاب قارچهای کریزوسپوریوم،تریکوفیتون و اسکو پولاریوپسیس،در تیمار کود حیوانی قارچ موکور و پسیلومایسس در تیمار کود کمپوست زباله، قارچ کلادوسپوریم،کریزوسپوریوم و تریکو درما و در تیمار کود گیاهی جنس کلادو سپوریوم،پسیلو مایسس، رایزو پوس و تریکو درما مشاهده شدند.وجود قارچهای تجزیه کننده سلولز مثل آلترناریا،آسپرژیلوس، فوزاریم،پنیسیلیوم و رایزوپوس بخصوص در تیمار کود گیاهی ، اهمیت این پروسه را نشان می دهد.همچنین بیشتر جمعیت آکتینومایست ها در کود کاه گندم و یونجه مشاهده شد . مقایسه میانگین جمعیت آکتینومایست ها نشان می دهد که کود گیاهی بالا ترین اثر معنی دار را نسبت به شاهد داشته و با کود کمپوست زباله اختلاف معنی داری ندارد. آکتینومایست ها در مراحل اولیه تجزیه مواد آلی تازه ،بعلت قدرت رقابت ضعیفی که در مصرف مواد کربن دار ساده با باکتریها و قارچها دارند، تعداد و فعالیتشان خیلی کم است اما به تدریج با کاهش مواد ساده و میکرو ارگانسیم های وابسته به این مواد، تعداد آکتینو مایست ها افزایش یافته و فعالیت خود را روی قسمتهای مقاوم باقی مانده شروع می کنند .
نتایج حاصل از بررسی تغیرات جمعیت کلیفرمها در تیمارهای مختلف نشان داد که در اولین زمان نمونه برداری ، کود حیوانی بیشترین آلودگی را از نظر تعداد کلیفرمها در خاک ایجاد کرده است. علت این امر را می توان تازه بودن کود حیوانی مورد استفاده عنوان کرد. در همین زمان کود های لجن فاضلاب و کمپوست زباله به ترتیب دارای بیشترین جمعیت کلیفرمها بعد از کود حیوانی بوده اند. در یک هفته بعد جمعیت کلیفرمها در خاک حاوی کود حیوانی هنوز جمعیت بالایی را نشان می دهند820×102 در 100میلی لیتر). در خاک تیمار شده توسط لجن فاضلاب جمعیت کلیفرمها به شدت کاهش یافته و به حدود یک چهارم خود رسیده اند. از آنجائی که کلیفرمها عمر کوتاهی دارند و بعنوان باکتریهای فرصت طلب در خاک شهرت دارند،پس از کاهش مواد مغذی مورد استفاده و همچنین رقابت سایر میکروارگانیسم ها با آنها ، جمعیت آنها در همه تیمارها در هفته سوم و هشتم نیز سیر نزولی داشته است.
نتایج تجزیه واریانس نشان می دهد که زمان نگهداری مخلوط کود و خاک ، اثر معنی داری در سطح یک درصد بر جمعیت کلیفرمها داشته است. همچنین مقایسه میانگین جعمیت کلیفرمها نشان می دهد که جمعیت کلیفرمها در اولین و دومین زمان نمونه برداری و همچنین در پنجمین و ششمین زمان نمونه برداری ، اختلاف معنی داری ندارد و تیمار کود حیوانی بیشترین اختلاف معنی دار در سطح 5 درصد با شاهد را داشته است اگر چه پیش از حصول نتایج ، به نظر می رسید که تیمار لجن فاضلاب می بایستی بیشترین جمعیت کلیفرمها را داشته باشد. علت این امر را می توان کاهش جمعیت کلیفرمها در طی مراحل تصفیه و همچنین قرار گرفتن در معرض نور خورشید در استخرهای ته نشینی فاضلاب عنوان کرد.