دانلود تحقیق ترکیبات نگهداری لیپید در باکتری های دریایی

چکیده

چهل باکتری دریایی (آبزی) استفاده کننده از روغن خام سایکر و تروفیک یا سایکرو تروفیک یا سایکروتروفیل (به ترتیب Psychrophile , Psychrotrophic (که ‌اولی ‌نوشته می شوند) برای توانشان جهت تراکم سازی ترکیبات نگهداری لیپیدشان در سیتوپلاسم در طی پرورشی تحت شرائط محدود کننده نیتروژن،‌مورد تحقیق و بررسی قرار گرفتند. بیشترشان (73%) قادر به تراکم سازی لیپیدهای عظیمی نظیر اسیدهای پلی هیدروکسی آلکانوئیک (PHA) بودند در حالیکه دیگر لیپیدها همانند استیرهای واکسن (موم) در دو ایزوله رخ می دادند. تراکم یا انباشتگی یا توده شدن PHA بطور غالب در دورهای پائین  20-4 ) طبق آنچه برای سه ایزوله نشان داده شد، رخ داد. میکروسکوپی الکترونی ضخائم پلی فسفات را که در دو ایزوله برای PHA رخ می دهد، آشکار کرد. سلولهای(1) Acineto bacter sp  (منبعد بصورت “A” می آید) ایزوله ، قادر به سنتز کردن و تراکم نمودن ضمائم لیپیدی در طی رشد بر استارت،‌اتانول،‌روغن زیتون ،‌هگزاد گانول و هپتادکان بودند. ترکیب و کمپوزیسیون ضمائم لیپیدی بر ترکیبات فراهم شده بعنوان منبع مرکزی ،‌بستگی داشتند. (سیترهای واکسن (موم = Wax ) واکیل گلیسرول ها اساساً در طی پرورش بر روغن زیتون رخ می دادند و در مقابل استرهای واکسن یا مومی و الکل های آزاد در طی پرورش بر هگزاد کانول رخ می دادند. کل اسیدهای چرب در سلولهای A  بالغ  بر میزانی تا 25% از وزن خشک سلولی در سلولهای رشد یافته بر روغن زیتون می شدند. اسید پالمیتیک (Palmiticacid) اسید چرب اصلی در لیپیدها در طی پرورش بر هگزاکانون ،‌هپتا دکان یا روغن زیتون رخ می دادند به منبع کربن مرتبط بودند. (اسیدهای چرب حاضر در لیپیدهای تراکم، بگونه ای غالب و محاط از اسیدهای چرب باز غده مستقیم اشباع شده و اشباع نشده با طول زنجیره متغیر از 12 تا 18 اتم کربن ،‌تشکیل می شدند. تحلیل و آنالیز پروتئین های توأم با لیپید دانه در سلولهای A پروتئین 

Kda 39 را بعنوان گونه پروتئینی غالب آشکار و واضح ساختند.

مقدمه:

شرایط محیطی (محیط زیست) که در ساحل خلیج (در آرژانتین)‌ San Jorge رخ میدهند، با دمای آب دریا تقریباً  5 و  15 ( به ترتیب) در فصول زمستان و تابستان و با درجه بالای آلودگی بواسطه نفت خام در برخی محلها با این اکوسیستم را برای ایزولاسیون میکروارگانیسم های و سایکروتروفیک و سایکروفیک (‌کننده در هیدروکربنی مطلوب می سازد. چنین ارگانیسم های منطبق شده با سرمایی قادر به بقا و قادر به رشد در محیط های سرد بوده که در بیشتر اکوسیستم های دریایی بوقوع می‌پیوندند. اینکه جمعیت میکربی محیط های دریایی اغلب در معرض دیگر شرائط همانند موجودیت مواد مغذی قرار می گیرند. میکروارگانیسم ها انوع استراتژی هایی که اجازه بقایشان در این محیط های متغیر را می دهند توسعه می دهند که تراکم نگهداری لیپیدها ‌یکی از انها است. ترکیبات نگهداری بطور نرمان بصورت ضمائم فوق سلولی در باکتری ها رخ می دهند.

تراکم ضمائم لیپیدی توسط یک ایزوله در طی رشد بر انواع طبقات فرعی می پردازیم

مواد و روش ها : منبع میکروارگانیسم ها ،‌محیط ها و روش غنی سازی

رشته های بکار رفته در این مطالعه از نمونه های آب دریایی سطحی که از روغن خام استفاده می کند (بعنوان تنها منبع کربنی) غنی شده و ایزوله شده است. نمونه ها از ساحل خلیج San Jorge در آرژانتین در طی دسامبر 199 و ‌1993 جمع آوری شدند.

دماهای نمونه ها بین  5 و  15 متغیر بودند یک کلکتور یا گیرنده فلزی گرفته شده و در تمام اوقات در یخ حمل و نقل می شدند. تقریباً mml5 آب دریا توسط کلیتراسیون از طریق یک فیلتر استریل غشایی با اندازه ‌روزانه  45/0 ،‌متراکم و کنسانتره شد. کنسانتره به سالین فیزیولوژیکی استریل ml50 اضافه شد و هم زده شد.

محیط معدنی (MSM) بنا به Schlege etal با ml5 از این سو از این سوسپانسیون آغشته شد (تلقیح شد) . پس از 7-5 روز از زمان تلقیح یا آغشته شدن در  7 این کشت جهت آغشتگی یا تلقیح پلیت های Msu/agar بکار رفت که حاوی روغن خام بعنوان منبع کربن بود و پلیت ها در  7 و  20 آغشته شد. (از ‌برای خلوص رشته های در حال رشد استفاده شد.

مورفولوژی ، آزمایشی بیوشیمیایی و رشد باکتری ها :

ایزوله ها جهت کسب شناخت و هویت رده بندی مقدماتی تحلیل و آنالیز شدند. آزمایشات و رده بندی ها بصورت زیر است: شکل سلول، شکل کلنی و رنگ Gramstian ، Catalase اکسیداز، تست of اصلاح شده Liefsen و آزمایش API20E ایزوله 211 در DSMZ وارد شد که هویتش بعنوان یک گونه از  را تأیید کرد و شماره کلکسیون 11042DSMZ را بدست آورد. سلولها بصورت هوازی در  4 یا 20 در محیط  (گوشت) غذایی یا محیط نمکهای معدنی رشد یافتند که با 2% کلراید سدیم و منبع کربن مربوطه تکمیل شد. جهت مجاز داشتن تراکم لیپیدها، غلظت و تراکم کلراید آمونیوم در محیط معدنی تا 05/0% کاهش یافت. جهت کسب محیط جامد شده 8/1% agar اضافه شد. برای بررسی میکروسکوپی ضمائم لیپیدی سلولها با B  سیاه Sudan با بکارگیری سفرانین بنا به Burdon مورد مطالعه قرار گرفتند. کل فسفات توسط آزمایش اسپکترومتری طبق شرح Watanabe folsen تحلیل و آنالیز شد.

عصاره گیری (استخراج) لیپید و کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

جهت تعیین کردن هویت لیپیدها TLC با نمونه های کل سلولهای استخراج شده با ترکیبی از متانول – کلرو فرم اجرا شد. کروماتوگرافی بر پلیت های ژل سیلیس 60 اجرا شد که سیستم های حلال زیر را بکار گرفتند. اسید استیک / اتر دی اتیل / هگزان .

کسرهای لیپدی توسط بخار ید قابل رویت بودند. عناصر مرجع زیر بکار گرفته شدند. اسید پالمیتیک ،‌اسید استریک دی پالمیتین تری پالمتیین ، گلیسرول rac میوسیتویل – دی پالمیتویل – آوا – ستیل پالمتیت و

1- هگزاد کانول

تحلیل و آنالیز اسیدهای چرب و PHA

جهت تعیین محتوای PHA یا اسید چرب سلولها و ترکیب مواد نگهداری اسیدهای چرب یا پلی استرها به اسید چرب تشکیل دهنده تغییر شکل یافتند. این اسیترها توسط کروماتوگرافی گازی با یک کروماتوگراف گازی مجهز یه ستون ‌MX25 Permaphase PEG و یک ردیاب یونیزاسیون شعله مورد تحلیل قرار گرفتند. نسبت  2 فاز ارگانیک پس از تقسیم تزریق تحلیل شد. هلیوم بعنوان گاز حامل بکار رفت . دماهای انژکتور و ردیاب  230 و  275 بودند. یک برنامه دمایی برای جدایی کارآمد استرهای متیل بکار رفت. به انضمام ردیابی استرهای متیل اسیدهای هیدروکسی آلکانوئیک این روش هم چنین اجازه ردیابی اسیدهای آلکانوئیک – n با 18-7 اتم کربن را می داد. اسیدهای چرب توسط قیاس مقادیر RF اسیدهای چرب استاندارد مربوطه شناخته شدند. برای تحلیل کمی اسید ‌یا اسید تری دکانوئیک و اسید تترادسنوئیک بعنوان استانداردهای داخلی بکار رفتند.

ایزولاسیون انضمام لیپیدی:

انضمام یا ضمائم لیپیدی توسط سانتری فوژ کردن در گرادیانهای چگالی بنا باد Preastiny etal ایزوله شدند. سلولها در MSM با روغن زیتون بعنوان تنها کربن تحت شرائط محدودگر نیتروژن بمدت 96-72 ساعت در محیط ml 1000-500 پرورش یافته و سپس توسط سانتری فوژ کردن برداشت شده و در TRIS/HCL مجدداً معلق شدند. پس از عبور سه گانه از یک  ‌فرانسوی (Prench) ، عصاره های بدون سلول بدست آمدند و ml 3-2 برا بالای یک گرادیان ساکاز و زلود شد. گرادیانهای ساکاروز مقطع از هر ml 2 از 3/0 و 6/0 و 2/1 و M 2 ساکاروز در TRIS/HCL مهیا شدند. گرادیان در 4 بمدت 5 ساعت در g 170000 سانتری فوژ شد. دانه ها یا گرده ها از گرادیانها جمع آوری شده و متعاقباً توسط 20 دقیقه سانتری فوژ کردن شسته شدند. ضمائم متعاقباً در معرض تحلیل شیمیایی و سولفات ‌سدیم قرار گرفتند.

الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید و تعیین کردن اسید آمینه  ترمینال

ضمائم ایزوله شده در بافر لور کننده ژل معلق شدند که حاوی 6/0% از SDS ، 25/1 % از 2- مرکاپتواتانول و mm 25/0 ‌Edta و 10% گلیسرول و 001/0% بروموفنول آبی در mm 25/1 از TRIS/HCL بود. پروتئین ها ‌شده و از دانه ها توسط تلقیح یا آغشتن 5 دقیقه ای در 100 رها شدند. پروتئین ها در ژل c 1% Sds/polyacylamid رها شدند طبق شرح Laemmli  و با آبی روشن Coomassie ، “A” طبق تشریح osborn و  Weber  یا توسط روش لکه گذاری نقره ای طبق تشریح Dernick و Heukeshofen لکه دار شدند. باندیاتوار ارائه گر پروتئین Mr 39000 جدا شد و رشته اسید آمینه –N ترمینال توسط تنزل Edman خودکار شده تعیین شد.