دانلود تحقیق جهش زایی آلودگی های مختلف هوایی (ذرات معلق)

خلاصه در این فصل و فصل بعد به بررسی آزمایشاتی می پردازیم که در طی آنها، جهش زایی آلودگی های مختلف هوایی (ذرات معلق) مورد مطالعه قرار می گیرند.

هدف از این فصل بررسی تاثیر آلودگی هوا بر روی جمعیت یک منطقه است.

جهش زایی ترکیبات آلی جدا شده (EOM) از ذرات معلق توسط آزمایشهای مختلفی از جمله کشت سالمونتلا، متد ترمیم DNA در سلول های کبد موش و آزمون میکرونوکلئوس در موش، مورد بررسی قرار گرفته است.

ذرات معلق از 13 ناحیه شانگهای در تابستان 92 جمع آوری شدند.

با جداسازی اسید باز، ترکیبات به سه جز اسیدی، بازی و خنثی تقسیم می شوند.

جز خنثی، توسط کروماتوگرافی خود به سه زیر جزء تقسیم می‌شود.

القای جهش های بازگشتی در نمونه های زمستان بیشتر از نمونه های تابستان بود.

جهش زایی های مستقیم و غیرمستقیم مورد بررسی قرار گرفتند.

موتاژنی با موش TA98 سالمونلا شناسایی می شود و نه با موش TA100.

بیشترین میزان جهش زایی در جزهای اسیدی، آروماتیک و قطبی از نمونه های تابستانی مشاهده شدند.

نمونه‌های زمستانی فرق مشخصی با نمونه های تابستانی نداشتند.

رابطه ای بین پراش منطقه‌ای EOMها بدست نمی آید ولی روابط زمانی و مکانی برای قوه جهش زایی ذرات معلق وجود دارد.

تمامی روش های آزمایشگاهی به کار برده شده، در تمامی موارد پاسخ مثبت دادند.

مقدمه شانگهای، یک شهر صنعتی در چین است که انواع کارخانجات مختلف در آن گردآورده اند.

با آن که صنایع بزرگ و آلاینده به خارج شهر منتقل شده اند، ولی هنوز جمعیت و بالا بودن تعداد وسائط نقلیه، هوای این شهر را آلوده می سازد.

در چند سال اخیر، سرطان ریه از مهم ترین عوامل مرگ و میر در هر دو جنس بوده است.

البته علت اصلی سرطان ریه، مصرف دخانیات اعلام شده است ولی با این حال باید به دو پرسش پاسخ دهیم.

اول اینکه تنها 36% از تمام سرطانها و 21% از مرگ ها ناشی از مصرف سیگار است، پس سیگار آن قدرها هم مهم نیست و باید فاکتومهای دیگری نیز وجود داشته باشد.

دوم اینکه نسبت سرطان ریه در مردها به زنها 3:1 است در حالیکه نسبت سیگار کشیدن 7:1 می باشد.

این اختلاف نیز قائدتاً ناشی از عوامل محیطی است.

تاثیرات آلودگی های هوای شهری در شهرهای مختلفی بررسی شده است.

طی این بررسی ها، بعضی از محققان موفق به نشان دادن توانایی این ذرات در جهش زایی شدند.

مطالعات اپیدیمیولوژیکی، به طور گسترده در 50 سال گذشته نشان می دهند که آلودگی هوا یکی از عوامل افزایش تعداد ابتلا به سرطان ریه است.

جهش زایی هوا در مناطق مختلف متفاوت است چرا که بافت آب و هوایی هر منطقه باعث تغییر در میزان آلودگی هوا می شود.

در ضمن منابع آلودگی هوا نیز در شهرهای مختلف متفاوت است.

تعدادی از تحقیقات در شهر شانگهای چین نشان دادند که ذرات معلق در هوا توانایی جهش زایی دارند ولی رابطه مستقیمی بین آلودگی هوا و سرطان ریه، نشان داده نشد.

در این فصل، سعی در روشن کردن نوع تاثیرات آلودگی بر روی موجودات زنده داریم.

بسیاری از آلاینده های آلی که بر روی سطح ذرات معلق می نشینند به عنوان سرطان را شناخته شده اند یا حداقل مورد ظن هستند.

برای تعیین توانایی ترکیبات مختلف در تولید جهش یا سرطان، نمونه های زیادی از مناطق مختلف این شهر تهیه شدند.

این نمونه برداری ها یک بار در ژانویه 1992 و بار دیگر در آگوست 1993 تکرار شدند.

تاثیرات آن ها در سه سطح جهش در ژنها، تخریب ترمیم DNA و تغییرات کروموزومی بررسی شدند.

لوازم و روشها - نمونه گیری و استخراج ترکیبات آلی نمونه های ذرات معلق توسط سمپلرهای با حجم بالا که مجهز به فیلترهای 20cm*20cm جمع آوری شدند.13 منطقه برای نمونه برداری انتخاب شد که مشخصات و محل آنها در جدول و شکل 1 نشان داده شده است.

نمونه های متعلق به 13 منطقه در یک زمان تهیه شدند.

وزن خشک فیلترها، قبل و بعد از نمونه گیری تعیین شد، تا وزن ذرات معلق جذب شده تعیین شود.

فیلترها تک تک شده و محتویات آنها توسط محلول نیمه قطبی دی‌کلرومتان (DCM) استخراج شد (سونیکاسیون به مدت 45 دقیقه).

محلول استخراج شده، یک بار دیگر فیلتر شده و به دو بخش تقسیم شد.

یک بخش حرارت داده شد تا خشک شود، سپس در حلال دی متیل سولفوکسید (DMSO) تا غلظت مناسب حلشد.

بخش دیگر با جداسازی اسید باز به سه قسمت: اسید، باز وخنثی تقسیم شد.

قسمت خنثی خود به زیر جزء تقسیم شد که زیرا اجزا برحسب قطبیت دسته بندی شده بودند.

این قسمت بندی توسط XAD-2 دزین- سیلیکاژل (با نسبت 1:1) در ستون کروماتوگرافی انجام می شود.

ستون با هگزان، بنزن و متانول پر شده بود تا ترکیبات آلیفاتیک، آروماتیک و قطبی از یکدیگر جدا شوند.

این قسمتها نیز تمامی خشک شده و پس از اندازه گیری وزن در DMSO حل شدند.

- متد سالمونتلا/ میکروزوم در تعیین جهش زایی در این روش ترکیبات مختلف در مجاورت سوشهای جهش یافته سالمونتلاتیفی موریم قرار می گیرند و هر چه تعداد جهش های بازگشتی و کلونی های رشد کرده بیشتر باشد، ترکیب جهش زاتر است.

در این آزمایش سوشهای سالمونتلا TA98 و TA100 مورد استفاده قرار گرفتند.

دزهای مورد استفاده برای استخراج خام دو بازه 100-400 Mg و برای هر جز 200-1000 Mg تعیین شد و از این بازه ها برای هر نمونه 3 دز متفاوت انتخاب شد.

ترکیبات 2-استیل آمینوفلوئورن (2-AF)، 7 و 2-دی استیل- آمینوفلوئورن (2,7-AF) و سدیم آزید (SA) به عنوان کنترل نسبت به کار رفتند و پلیتها برای 48h در دمای 37 درجه قرار گرفتند.

سپس کلنی های تشکیل شده نمایش شدند.

سنتز DNA غیر به برنامه ریزی شده سلول های تازه کبد موش در محلول DMEM به همراه 5% سرم بوین و هیدروکسی اوره (0.01M) قرار گرفتند.

سلولهای موجود در محیط در حدود 106*1 سلول تنظیم شد.

1 میلی لیتر از سوسپانسیون سلولی به یک لوله آزمایش منتقل شد.

10 میکرکوری از تیمیدین- [3H] و غلظتهای مختلفی از نمونه های مورد مطالعه اضافه شدند.

لوله در شیکر به مدت 3h در دمای 37 درجه قرار گرفت.

سلولها توسط فیلترهایی جدا شده و مقدار تیمیدین- [3H] آنها تعیین شد.

- مدد میکرونوکلئوس روش های باسن 7 تا 8 هفته و وزن 18-25g در این آزمایش مورد استفاده قرار گرفتند.

این موش ها به 41 دسته پنج تایی دسته بندی شدند و هر یک بدین ترتیب مورد تیمار قرار گرفتند.

(a) محلول کنترل منفی (b) مسیتوکین (کنترل مثبت) (c) غلظت های 100,20,4 میلی گرم در میلی لیتر نمونه های استخراج شده.

سوشها هر 24 ساعت 1 بار مورد تزریق قرار می گرفتند.

6 ساعت پس از آخرین تیمار، موش ها قربانی شده و مغز استخوان آنها جدا و رنگ آمیزی شد و گسترش ها برای وجود هسته در گلبول قرمز مورد مطالعه قرار گرفتند.

- آمار تمامی تحلیل های آماری توسط آزمون t انجام شده اند.

نتایج - غلظت، قابلیت استخراج ماده آلی و توزیع آن غلظت ذرات معلق در هوا هر یک از مناطق نمونه برداری در جدول 2 آمده است.

غلظتهای بدست آمده از مناطق مختلف، به جز منطقه k در بقیه مناطق تقریباً یکسان بود.

در واقع منطقه k به عنوان یک شاهد انتخاب شده است.

غلظت ذرات معلق در زمستان حدوداً دو برابر تابستان است.

جدول 3 خلاصه ای از مقدار ترکیبات به دست آمده در هر یک از اجزاء استخراج شده است.

از این جدول این گونه نتیجه می شود که پس از جداسازی اسید و باز، بیشترین مقدار ماده در فاز خنثی و کمترین آن در جز بازی است و این نتیجه مستقل از فصل نمونه گیری و یا محل آن است.

مقایسه مقدار ترکیبات آلی استخراج شده از نمونه E، نشان می دهد که EOM در زمستان بیشتر از تابستان است.

مقدار ترکیبات آلی در اجزای مختلف در نمونه های متفاوت با یکدیگر تفاوت داشت.

بیشترین مقدار به دست آمده، در زیر جز قطبی در زمستان بوده است (35-45%).

جزء آروماتیک که حاوی پلی سیکلیک آروماتیک ها می باشد، 7.8-11.5% کل EOM را تشکیل می‌دهد.

بازهم در نمونه E، جزء آروماتیک تفاوت فصلی زیادی را از خود بروز می‌دهد (11.5-44.8%).

- قابلیت جهش زایی EOM جدول 4 نتایج مربوط به متد جهش زایی را در موش TA98 نشان می دهد.

تمامی استخراج های دست نخورده، رابطه مستقیمی بین دز و پاسخ نشان می دهند، البته به غیر از نمونه های M,L که در صورت حضور S9 از خود کاهش نشان می دهند.

موش TA100 برخلاف TA98، یک رفتار وابسته به دز از خود بروز نمی دهد.

اگر تعداد کلنی های بازگشتی موجود در یک پلیت را که دو برابر یا بیشتر از کنترل هستند، به عنوان پاسخ مثبت قبول کنیم: شکل 2 کمترین دزی را نشان می دهد که در پلیت متناظرخود پاسخ مثبت می‌دهد(Minimum Effective Mutagenic Dose:MEMD).

تاثیر مستقیم استخراج دست نخورده در جهش زایی در فصل ها و مناطق مختلف یکسان است.

تاثیر غیرمستقیم استخراج ها در زمستان بیشتر از تابستان و به طور کلی در مناطق مختلف نیز متفاوت است.

به عنوان مثال مناطق K,C؛ I و M قابلیت جهش زایی نسبتاً قویتری دارند.

غلظت ذرات معلق نیز در مقدار جهش زایی آن تاثیر دارد.

در شکل 3 قابلیت جهش زایی در هر متر مکعب از هوا نشان داده شده است که نشان می‌دهد نمونه های زمستانی قابلیت جهش زایی بالاتری دارند.

- قابلیت جهش زایی اجزاء در زیر اجزاء چهار نمونه برای جزء جزء شدن انتخاب شدند.

اطلاعات در جدول 6 آورده شده است و نشان دهنده فعالیت های موتاژنی اجزای مختلف بر روی TA98 است.

در نمونه های تابستانی، رابطه دز- پاسخ دیده می شود (مستقل از حضور یا غیاب S9).

در نمونه های زمستانی، افزون S9 تعداد جهش یافته ها را به شدت افزایش می دهد (در سوش TA98).

تمامی اجزای نمونه های K,I، رابطه دز- پاسخ را نشان می دهند، چه در حضور و چه در عدم حضور S9.

فعالیت موتاژنی نمونه A، عمدتاً شامل تاثیرات غیرمستقیم بوده و رابطه دز- پاسخ مشاهده می شود.

زیر جزء خنثی در نمونه E، رابطه دز- پاسخ را همواره نشان می دهد.

زیر جزء اسیدی موتاژنی غیرمستقیم و زیر جزء بازی مستقیم را از خود بروز می دهند.

نتایج حاصل از سوش TA100 هیچ پاسخ مثبتی را نشان نمی دهند.

شکل 4 نشان می دهد که اجزای اسیدی، قطبی و آروماتیک حاصل از نمونه های تابستانی، فعالیت بیشتری را نشان می دهند.

توزیع فعالیت موتاژنی تفاوت زیادی را در بین نمونه های زمستانی نشان نمی دهد.

- سنتز غیربرنامه‌ریزی شده DNA در سلولهای کبد پس از تیمار باEOMها(UDS) در شکل 5، نتایج آزمایشهای UDS آورده شده است.

رابطه دز- پاسخ به خوبی قابل مشاهده است.

نمونه های مختلف پاسخ نسبتاً مشابهی بروز می دهند و تفاوتهای مکانی و زمانی تاثیر چندانی ندارند.

از آنجا که محدودیت جمع آوری نمونه وجود داشت تنها نمونه های K,E برای تعیین تاثیر جهش زایی مورد استفاده قرار گرفتند.

بیشترین میزان موتاژنی از زیر جزء قطبی نمونه E و یا زیر جزءهای آلیفاتیک، آروماتیک و قطبی نمونه K به دست آمد.

تفاوت خاصی میان نمونه های زمستانی مشاهده نشد.

- تشکیل میکرونوکلئوس در موشهای تیمار شده با نمونه های استخراج شده نمونه‌های دست نخورده زمستانی در این آزمایش مورد استفاده قرار گرفتند.

نمونه‌ها رقیق شدن تا غلظت 4، 10 و 100 میلی گرم بر میلی لیتر.

نتایج در شکل 6 نشان می‌دهند که تیمار موشها با این نمونه ها، تعداد سلولهای دارای میکرونوکلئوس را به مراتب بیشتر از موش کنترل منفی می کند.

تفسیر شانگهای به عنوان بزرگترین شهر کشور چین به حساب می آید که در کنار دریای “بو” قرار گرفته است و در نتیجه دارای یک آب و هوای بندری است.

این شهر دارای صنایع متفاوت و مهمی است (الکترونیک، داروسازی، پتروشیمی و...) که در مناطق مختلفی از شهر توزیع شده اند.

بسیاری از این صنایع تولید آلودگی می کنند چرا که فاقد دستگاه های کنترل مدرن می باشند.

در این میان، افزایش اتومبیلهای سنگین، سوخت دیزل را یکی از مهم ترین عوامل آلودگی در این شهر ساخته است.

مرگ و میر حاصل از سرطان ریه در چند سال اخیر به شدت در شانگهای افزایش یافته است.

تحقیقات اپیدمیولوژیکی رابطه مستقیمی بین شیوع سرطان ریه و آلودگی هوا نشان می‌دهند.

در این فصل، به بررسی عوامل جهش زا در آلودگی هوا پرداختیم و روشهای آزمایشگاهی مرتبط با آنها را معرفی کردیم.

اطلاعات قبلی ما حاکی از این است که ذرات معلق قادرند به طور مستقیم و یا غیرمستقیم باعث وقوع جهش شوند.

هر دو گونه این جهش زایی ها در نمونه های ما نیز یافت می شوند.

سوش TA98 وقوع جهش های بازگشتی را نشان داد و نه سوش TA100 که موید این نظریه است که این موتاژن ها جهش های با تغییر چهارچوب را باعث می شوند.

برای تعیین جهش زاترین ترکیب، ترکیبات مشابه در جزءهای یکسان قرار گرفتند.

فعالیت موتاژنی در اجزائ اسیدی، آروماتیک ون قطبی مقدار بیشینه داشت (در نمونه‌های تابستانی).

مقادیر به دست آمده برای نمونه های زمستانی از تنوع بالاتری برخوردار بود.

فعالیت موتاژنی هر جزء با مقدار آن جزء در تابستان نسبت مستقیم دارد ولی مستقل از غلظت در زمستان عمل می کند.

تمامی این نتایج را می توان با تغییرات غلظت آلودگی ها توجیه کرد، در زمستان اوضاع کمی پیچیده تر است، آن هم به دلیل وجود منابع آلاینده متنوع که در زمستان به مراتب بیشتر از تابستان است.

جزء آروماتیک دارای پلی سیکلیک آروماتیک هیدروکربن ها می باشد که دارای خاصیت جهش زایی مستقیم و غیرمستقیم است.

تره موتاژنی PAH ها در تابستان به مراتب بیشتر از زمستان است.

این مطلب به این مسئله مربوط است که در زمستان آلودگیها عمدتاً ناشی از سوخت اتومبیل هاست.

ذرات حاصل از سوختن دیزل حاوی PAHها می باشد.

البته علاوه بر جزء آروماتیک، اجزاء اسیدی، قطبی نیز از اهمیت بسزایی برخوردارند.

همچنانکه مطالعات نشان داده اند که نیتروآروماتیکها نیز که در جزء اسیدی قرار می‌گیرند دارای فعالیت موتاژنی بالایی هستند.

مراجع 1.

X.Zhao, Z.Wan, B.

Chen, H.

Zhu, S.

Fiang, J.

Yao (2002), “Gonotoxic activity of extractable organic malter from urban airborne particles in shanghai, China”, Mutation research, 514, 177-092.

2.

F.

Jin, SS.

DEvesa, W.

Zheng, WJ.

Blot, JF.

Fraumen, YT.

Gao, (1993),“Cancer incidence trends in urban shanghai”, Cancer, 53, 764-770.

3.

HG.

Zhu, QY.

Zhao, SH.

Jaing, (1991), “The mutagenicty of the extracts of suspended particles in shanghai”, Shanghai, Envion.

Sci, 10, 10-13.