مقدمه ازاولین تلاش علمی بشر برای پیشگیری از بیماری عفونی به وسیله ایمن سازی بدن که توسط Edward jenner در سال 1790 صورت گرفت،تاکنون واکسیناسیون به یکی از مهم ترین رکن های پیشگیری از بیماری عفونی به خصوص آن هایی که توسط ویروس ها ایجاد می شوند تبدیل شده است(7) در قرن هجدهم لویی پاستور براساس مشاهداتی که روی طرز انتقال بیماری وبای مرغان و پیشگیری اتفاقی آن با تزریق کشت کهنه ی عامل بیماری داشت، اولین واکسن تخفیف حدت یافته را علیه بیماری شاربون (سیاه زخم) وسپس هاری تولید کرد(2) محققان اولین واکسن DNA نوترکیب را بر ضد هپاتیت B درسال 1986 بهسازی کردند(7) سابقه واکسناسیون نوین در ایران به اوایل سلسه ای قاجاریه یعنی پادشاهی فتحعلی شاه باز می گردد که در سال 1245 به دستور عباس میرزا نایب السطنه ایران، لشگر او توسط پزشکان انگلیسی درتبریز آبله کوبی شد، و در ادامه به دستور میرزا تقی خان به تمام ایران تعمیم داده شد(1) با انجام واکسناسیون جهانی در سال 1970 بیماری آبله ریشه کن شد.
به دنبال این دستاروردها تولید واکسن به خصوص درقرن بیستم سرعت یافت به طوری که امروزه بیش از 50 نوع واکسن دردامپزشکی و پزشکی تولید و مصرف می شوند.
که این رقم تنها شامل واکسن های باکتریایی و ویروسی می باشد.
با توجه به تولید انواع دیگری از واکسن علیه بیماری های انگلی و تک یاخته ای (مانند کوکسیدیوز طیور، تیلریوزگاو) این رقم بیشتر نیز خواهد بود(7) که البته تمام این دستاوردها ارتباط غیر قابل انکاری با حیوانات آزمایشگاهی وانجام آزمایش های کنترلی بر آن ها دارد.
با توجه به اهمیت واکسن ها در طب نوین و لزوم افزایش آگاهی در این مقاله به مروری بر روند تولید واکسن ها و کنترل کیفیت آن ها و نقش حیوانات آزمایشگاهی در این روند پرداخته می شود که البته به علت گستردگی علم واکسن شناسی تنها به واکسن های باکتریایی ویروسی اشاره می شود.
تولید و بهسازی: هدف از تولید واکسن فراهم کردن محصولاتی با کیفیت بالا به منظور ایجاد ایمنی اختصاصی است که به دنبال تجویز آن واکنش مضر وجدی ایجاد نشود.
به طور کلی اغلب واکسن های موجود منشأ باکتریای یا ویروسی دارند و تغییرات ایجاد شده روی آن ها اکثراَ شامل غیر فعال سازی تا تخفیف حدت خود میکروارگانیسم حاد یا ترکیبات آن می باشد در مواردی هم برحسب نیاز سویه های غیر حاد (مانند واکسن یا لاسوتا علیه بیماری نیوکاسل طیور) استفاده می شود.
تولید و بهسازی محصولات جدید یکی از مهم ترین مراحل تحقیقات واکسن است تا چندی پیش بیشتر توجهات روی بیماری های باکتریایی و ویروسی بود ولی اخیراَ پیشرفت های علمی افق های باز دیگری را گشوده است و در حال حاضر واکن های متعددی به منظور کنترل بیماری های تک یاخته ای و انگلی استفاده می شود.
امروزه واکسن های زیادی از جمله واکسن های Subunit و واکسن های فراوری شده بامهندسی ژنیتیک تولید و بهسازی شده اند شیوه های بهسازی واکسن های جدید بسیار متغیر است و بر حسب انواع ویروس یا باکتری متفاوت است.
معمولاَ برای انتخاب مواد اولیه، فرمولاسیون، ایجاد تثبیت فرمول و تعیین روش و دفعات تجویز واکسن به حیوانات آزمایشگاهی نیاز است(7) به طور کلی برای بهسازی یک واکسن نیاز به تحقیقات گسترده ای روی حیوانات است، اگر جه این نیاز همیشگی نمی باشد در حال حاضر وجود یک حیوان تحقیقاتی مناسب برای تحقیقات آسیب شناسی و میکروب شناسی اهمیت بسیار دارد.
موش اولین گونه حیوانی بود.
که در تولید واکسن از آن استفاده شد(7) البته حیوانات آزمایشگاهی بیشتر در کنترل کیفیت محصولات نقش دارند تا تولید.
به خصوص در تولید واکسن های باکتریایی نقش آنها فرعی می باشد و تنها گاهی برای تهیه محیط کشت به محصولات حیوانی مثل سرم و یا خون مورد نیاز است ولی شرایط در مورد واکسن های ویروسی متفاوت است.
و برای تهیه کشت سلولی اولیه که به طور مستقیم از حیوانات منشاء می گیرد از آن ها استفاده میشود.
به دنبال جایگزینی کشت های اولیه با محیط Subculture cell (مثل: سلول های تترادبرای فلج اطفال) تعداد حیوانات مورد نیاز برای تولید واکسن به تدریج کاهش یافته است(5) درمورد واکسن های انسانی قبل از آزمایشات کلینیکی روی انسان باید یک مدل حیوانی مناسب طراحی شود، که نتایج حاصله با داده ها و اطلاعاتی که در مورد انسان موجود است مقایسه شود.
این داده ها معمولاَ بر اساس نتایج آزمایشاتی است که واکسیناسیون بر روی یک جمعیت بزرگ تحت شرایط کنترل شد اجرا شده باشد(2) 3- مراحل تولید واکسن باکتریایی 1)اولین مرحله تولید واکسن های باکتریایی تعیین ماده اولیه یا همان سویه باکتری است که معمولاَ این سویه ها سال هاست برای مقاصد تولیدی مورد استفاده قرار گرفته اند.به همین منظورسویه درون نیتروژن مایع یا به صورت یخ خشک در محیط بدون آب فریز شسده و ذخیره می گردد تا به عنوان یک منبع ثابت ماده اولیه همیشه دردسترس باشد که به آن Seed lot می گویند.
برای هر سری تولید(batch) نمونه میکروارگانیسم از Seed lot گرفته شده و در محیط های اختصاصی جامد یا مایع کشت داده می شود.
پس از طی دوره لازم، حاصل کشت های باکتریایی یا مایع کشت های حاوی سموم باکتریایی جمع آوری می شود که به آن Bulk واکسن خام گویند.
چون این محصول معمولاَ با ترشحات باکتریایی و یا ترکیبات و اجزای محیط کشت آلوده است و مهمتر این که غلظت پادگنی پایین دارد.
مرحله بعد شامل تغلیظ و تخلیص آن می باشد.
در مورد واکسن های کشته فرایند غیر فعال سازی که اغلب با فرمالین انجام می شود در همین مرحله است در صورت لزوم، افزودن ماده ی یاور ایمنی به واکسن نیز در همین مرحله صورت می گیرد.
محصول این مرحله بالک پالایش شده یا توکسوئید پالایش شده نام دارد.
مرحله آخر پروسه تولید، پرکردن آمپول ها یا ویال های واکسن با ذز مناسب می باشد که به آن ها Final lot می گویند که در صورت لزوم آن ها را در محیط بدون آب فریز می کنند (لیوفیلیزه)(6)(5) seed lot را سویه باکتریایی یا ویروسی که در master seed lot استفاده می شود، این سویه از طریق پیشینه تاریخی که شامل اطلاعاتی در مورد منشأ سویه و کاربردهای بعدی آن است شناخته می شود هیچ میکروارگانیسمی غیر از سویه بذر نباید در seed lot وجود داشته باشد.
مراحل تولید واکسن های ویروسی بسیر شبیه به تولید واکسن های باکتریایی می باشد.
دراین جا هم با مراحل و واژه های Seed lot (بذر اولیه)، تغلیظ و پالایش سوسپانسیون، بسته بندی و به دنبال آن فریز کردن در محیط فاقد آب و خشک که به منظور افزایش تاریخ انقضاء واکسن در بسیار از واکسن های ویروسی انجام می شود مواجه هستیم.
با وجود این، تفاوت هایی هم در این میان وجود دارد.
واژگان دیگری هم در مورد فرایند تولید واکسن ویروسی به کار می رود مانند سوسپانسیون ویروسی.
(مثل: واکسن غیر فعال فلج اطفال و هاری) به کار گرفته می شوند.
این در حالی است که در واکسن های زنده(مانند واکسن فلج اطفال (خوراکی)،سرخک و اوریون و برونشیت عفونی) که ویروس واکسن پس از تجویز در بدن فرد همچنان تکثیر خواهد کرد، نیاز به مقدار کم تری ویروس می باشد(5) کنترل کیفیت: کارخانه های تولید کننده واکسن با انتخاب مواد اولیه مناسب و استاندارد سازی روش های تولید و برای تولید محصولات با ثبات و کیفیت بالا تلاش و رقابت زیادی می کنند، با وجود این کنترل کیفیت، یکی از مهم ترین مراحل فرایند تولید می باشد و کوتاهی در آن می تواند عواقب فاجعه آمیزی را در پی داشته باشد، برای مثال در سال 1901 به دنبال مصرف آنتی توکسین دیفتری که از سرم اسب آلوده به باسیل کزاز تهیه شده بود، 13 کودک به علت کزاز مردند(7) و در سال 1955 به دنبال واکسیناسیون با واکسن فلج اطفال 79 مورد بیماری گزارش شد که به علت کافی نبودن ارزیابی بی خطری واکسن استفاده شده، 7 تا از 17 batch عوامل متفاوتی می توانند در تولید یک batch واکسن دخیل باشند مانند مواد بیولوژیک .
و همچنین فرایند تولید که می تواند بسیار پیچیده باشد.
بنابراین هر batch تولید شده ممکن است با دیگیری متفاوت باشد و کنترل کیفیت باید بر روی هر batch به تنهایی صورت گیرد.(5) کنترل کیفیت هم در مورد batch خام و هم در مورد batch پالایش شده، چه در حین تولید (in- process control) وچه در آخر فرایند تولید در خلال مرحله پایانی آن لازم و ضروری است .(5) حیوانات آزمایشگاهی هنور به عنوان اصلیترین شاهد در تشخیص فعالیت های مطلوب و غیر مطلوب batch های واکسن های تولیدی می باشند(7و5) و نوع ماده ی اولیه واکسن و فرم ارائه آن (واکسن تخفیف حدت یافته، توکسوئید، کشته، غیرفعال یا سویه های کم حدت) تعیین می کند که آزمایشات و به ویژه نوع سیستم invivo به چه نحوی باید اجرا شود.
به طور کلی کنترل کیفیت شامل 2 بخش است: 1) ارزیابی بی خطر بودن Safty 2) ارزیابی توانمندی یا اثر بخشی (potency, efficacy) 5-1 ارزیابی بی خطر بودن واکسن دراین ارزیابی ثابت می شود که واکسن عاری از هرگونه ماده آسیب رساننده به حیوان یا انسان پس از تجویز آن می باشد این مخاطرات را در موارد زیر می توان یافت: الف: عامل اولیه استفاده شده (سویه باکتری، سویه توکسوئید یا ویروس) ب: مواد شیمیایی افزوده شده به واکسن (تعمیدی یا غیر تعمیدی) پ: نوع سوبسترای استفاده شده (محیط کشت، کشت سلولی، تخم مرغ جنین دار، سرم، مایع واکسن،....) الف: آزمایش هایی که با هدف بررسی احتمالی توانایی آسیب رسانی عامل اولیه واکسن به عنوان بخشی از آزمایش های بی خطری واکسن انجام می شوند، شامل موارد زیر است: الف: آزمایش هایی که با هدف بررسی احتمالی توانایی آسیب رسانی عامل اولیه واکسن به عنوان بخشی از آزمایش های بی خطری واکسن انجام می شوند، شامل موارد زیر است: 5-1-1 آزمایش مسمومیت زایی اختصاصی این آزمایش برای تشخیص باقی ماندن هرگونه حدت و بیماری زایی در واکسن های باکتریایی زنده و یا تشخیص غیر فعال سازی ناقص در واکسن های کشته باکتریایی یا توکسوئید به کار می رود.
در مورد واکسن های ویروسی از اصطلاح آزمایش غیر فعال سازی استفاده می شود.
و به این منظور گروه هایی از حیوانات مختلف با دوزی از محصول خام یا پالایش شده چندین نوبت بیشتر از حدی که در انسان به منظور ایمنی زایی استفاده می شود، تزریق می شود.
در واکسن های توکسوئیدی ، استاندارد تعیین شده، وقوع نشانه های بالینی یا تغییرات ماکروسکوپیک می باشد.
درآزمایش بی خطری واکسن سیاه سرفه بر اساس تأثیر باکتری (که به طور ناقص غیرفعال شده است) بر روی وزن گیری موش می باشد.(6)،(5) 5-1-2 آزمایش زنده باقی ماندن ویروس این آزمایش در واقع آزمایش صحت غیر فعال سازی ویروس می باشد و طی آن با استفاده از کشت سلولی یا تزریق ویروس به داخل مغز موش بیماری زایی یا زنده بودن ویروس تحت بررسی قرار می گیرد.
در صورت غیر فعال سازی ناقص علائم بالینی و مرگ ایجاد می شود.(5) 5-1-3 آزمایش تعیین هویت (identity test) این آزمایش برای مطمئن شدن از یکسان بودن پادگن موجود در واکسن با ماده اولیه واکسن انجام می شود(5) یعنی محصول، تولید پادتن مشخصی را در حیوان به دنبال ایمنی سازی تحریک می کند.
که معمولاَ از روش های invitro برای این منظور استفاده می شود، در مواردی که استفاده ازسیستمinvivo لازم می باشد باید به دنبال ایمن سازی حیوان با سویه های حدت دار بیماری یا آزمایش های سرولوژی صورت می گیرد (7) نتایج منفی حاصله مشخص می کند که برای مثال ظروف نگه داری ماده اولیه احتمالاَ عوض شده یا این که بر چسب های بسته های مواد اولیه اشتباه بوده است.
ب: در طول فرایند تولید ممکن است انواع مختلفی مواد زمینه ای شیمیایی ماننند یاور ایمنی ها، مواد نگهدارنده ، ماده ضد کف.
مواد غیرفعال کننده و.....
به واکسن اضافه شود.
میزان غلظت این مواد معمولاَ به روش های شیمیایی بررسی می شود.
اشتباه در این بخش ممکن است عواقب فاجعه باری را(مانند استفاده از تجهیزات آلوده به مواد شیمیایی)در پی داشته باشد بدین منظور آزمایش بی گزندی (innocuity) انجام می شود.
5-1-4 آزمایش بی گزندی این آزمون هنگام پروسه بسته بندی یا انجام آزمایش های مسمومیت زایی غیر طبیعی بر روی تعدادی آمپول انجام می شود و در آن از حیوانات آزمایشگاهی استفاده می شود.
پ: موادسوبسترایی که به صورت اختصاصی در ساخت واکسن استفاده می شوند یکی از مخاطرات واکسن سازی می توانند باشند.
ترکیبات مشتق شده از حیوانات که در محیط های کشت استفاده می شوند مانند سرم (در واکسن های باکتریایی و توکسوئیدی )، کشت های سلولی سرم و تخم مرغ جنین دار (واکسن های ویروسی) می توانند با میکروارگانیسم ها یا محصولات آن ها آلوده باشند.
به علاوه این مواد میتوانند توسط محیط و افراد هم آلوده شوند بنابراین در آزمایش بی خطری باید به شناسایی وردیابی این گونه آلودگی ها توجه لازم مبذول داشت و به این منظور آزمایش های زیر صورت می گیرند.(5) 5-1-5 آزمون سترونی یک آزمایش عموی می باشد که با هدف ردیابی آلودگی با عوامل باکتریایی، قارچی و مایکوپلاسما در مورد هر واکسن باکتریایی و ویروسی انجام می شود.
تست های استریلیتی معمولاَ بر اساس استفاده از مدل های invitro می باشد.(6) 5-1-6 آزمون ردیابی میکروارگانیسم های بیگانه برای تشخیص میکروارگانیسم های بیگانه استفاده میشود، این آزمایش تنها در واکسن های ویروسی و تهیه ایمونوگلوبولین با منشاء حیوانی محدود می شود.
هم در سیستم invivo و هم در سیستم invitro می تواند اجرا شود.(5) مثل: ویروس های مخفی در بافت های حیوانی که برای تولید واکسن استفاده می شود(7) برای واکسن های ویروسی انسانی با تجویز درون صفاقی و داخل مغزی واکسن در موش های بالغ و تازه متولد شده و با مشاهده علائم بالینی و یا آنتی بادی های اختصاصی در سرم خون انجام می گیرد.(6) 5-1-7 آزمایش حضور آندوتوکسین جهت انجام این تست هر دو روشinvivo و invitro به کار گرفته می شود.
تذکر: انجام این آزمون در مودر واکسن های باکتریایی رسمی مورد تأکید قرار نگرفته است.(5) 5-1-8 آزمایش تومورزایی برای تشخیص مواد آنکوژن (سرطانزا) در سلول هایی که برای تولید واکسن های ویروسی به کار می روند کاربرد دارد.(7) سلول هایی که جهت ساخت واکسن های ویروسی استفاده می شوند و از نوع کشت های سلولی اولیه نمی باشند ممکن است خواص سرطان زایی داشته باشند.
استفاده از این گونه سلول ها جهت ساخت واکسن های انسانی تأیید نشده ، بخشی از ملزومات مرسوم که جهت تأیید شدن سلول های ساب کالچر و دودمانی سلولی مورد بررسی قرار می گیرند، نداشتن خاصیت تومورزایی است که این مسئله را می توان با استفاده از آزمایش های حیوانی ( که در همه آنها از حیوانات با ایمنی سرکوب شده استفاده می شود) بررسی کرد مدل های مختلفی برای آزمایش تومورزایی وجود دارد .
به عنوان مثال دو گروه حیوان مورد استفاده قرار می گیرد (رات، موش یاهامتسر که دستگاه ایمنی آن ها سرکوب شده)(5) به یک گروه به عنوان گروه شاهد، سلول های توموری خاصی را به صورت زیر جلدی ترزیق می کنند و به گروه دیگر سلول های کشت سلولی استفاده شده در تولید به روش زیر جلدی تزریق می شود.
سپس هر دو گروه برای پیشرفت تومور مقایسه می شوند، استاندارد تعیین شده ، ایجاد تومور در محل تزریق یا در بعضی مواقع متاستاز تومور می باشد.(7) 5-2 ارزیابی توانمندی از یک واکسن مؤثر انتظار می رود که ایمنی محافظت کننده ای را به دنبال تجویز القا کند و برای این منظور هر سری تولید (batch) هم از نظر کیفی و هم از نظر کمی مورد ارزیابی قرار می گیرد (7) با توجه به تأثیر واکسن ها ، بین تعیین مقدار آنتی ژن و تعیین ایجاد توانائی ایمنی محافظت کننده تفاوت وجود دارد (4) در مورد واکسن های زنده تخفیف حدت یافته ، آزمایش آنتی ژنیسیته که یک آزمایش در محیط invitro است براساس شمارش یا کشت میکروگانیسم های واکسن برای تست batch کافی است و تعداد اجرام زنده با شمارش و یا تیتراسیون مشخص می شود .
البته این مسئله نسبی است ، برای اینکه رونوشت ویروس واکسن یا باکتری بعد از تجویز در بدن ادامه دارد (4) تنها هنگامی که واکسن تولید شده از سویه های جدید می باشد از سیستم invivo جهت آزمون ارزیابی توانمندی استفاده می شود .
(7) واکسن های غیر فعال توانائی کمتری دارند و تنها مقادیر آنتی ژن موجود در واکسن در ایجاد ایمنی نقش دارد (6) به منظور اطمینان از توانمندی واکسن های غیر فعال از روش های invivo استفاده میشود (6) اگرچه ارتباط بین مقادیر آنتی ژن و ایمنی محافظتی ایجاد شده با آن وجود دارد ، این ارتباط دائمی نیست .
فاکتورهای محافظتی می توانند بر روی توانمندی آنتی ژن تأثیر بگذارند مثل : طریقه تجویز و محل آن یا اضافه کردن ادجوانت و یا ترکیب با سایر فرآوردها آزمایش ایمنی زایی برای کنترل کیفیت نهایی فرآورده لازم است و معمولاً بر پایه مدلهای حیوانی می باشد ، گونه های حیوانی به کاربرد شده معمولاً با گونه هدف یکسان نیستند و با واکسن های انسانی نیز یکسان نمی باشند .
در میان تمام آزمایش های کنترل کیفی واکسن های غیر فعال بیشترین مورد استفاده از حیوانات آزمایشگاهی در این مرحله است .
(7) پیشرفتهای تازه امروزه با روش های مهندسی ژنتیک واکسن های جدیدی تهیه شده اند که وزارت کشاورزی امریکا USDA اینگونه واکسن را به سه دسته تقسیم نموده است : 1)پادتن هایی که به وسیله مهندسی ژنتیک تولید شده است: که توالی کد کننده ی پادگن مورد نظر را وارد سلول دریافت کننده می کند و سپس این سلول پادتن مورد نظر را به مقدار زیاد تولید می کند.
2)تخفیف حدت میکروارگانیسم به روش های ژنتیکی: در این روش با بریدن و حذف ژن هایی که در تکثیر ویروس لازم نبوده ولی در بیماریزایی دخالت دارند.
می توان موتانت های حذفی جدید را ایجاد کرده و در تولید واکسن به کار برد.
3)واکسن های تهیه شده از ویروس های حامل: آن هایی که پادگن را کد می کنند را می توان وارد انواع میکروارگانیسم ها کرد و سپس میکروارگانیسم های حاوی این ژنها را می توان مستقیماً به عنوان واکسن به کار برد.
تا کنون تنها واکسن های مورد استفاده در این زمینه، واکسن حاصل از ویروس واکسینا و هاری جهت واکسیناسیون روباه ها در اروپا و راکون ها در آمریکا بوده است.
نوآوری های دیگری هم در زمینه تولید واکسن به دست آمده است از جمله DNA خالص یا پیتیدهای سنتتیک که این دستاوردها اغلب در حد آزمایش بوده و ایمنی کمی ایجاد کرده اند.(3) امروزه محققین به دنبال راهی هستند که از طریق اطلاح ژنتیک، گیاهان را تغییر بدهند و بتوانند علیه بیماری های عفونی ایمنی ایجاد نمایند.
مطالعات گذشته نشان داده که گیاهان مهندسی ژنتیک شده می توانند مثل واکسن عمل کنند و باعث پاسخ ایمنی در موش هایی که از این گیاهان تغذیه کرده اند شوند.
از مزایای گیاهانی که به عنوان واکسن عمل می کنند تولید ارزان آن است که می تواند برای کشورهای در حال توسعه بسیار مفید باشد.
به علاوه چون کشت سلولی در مراحل تولید آن به کار نمیرود و آلودگی با ویروس های حیوانی نیز از بین می رود و بسیاری از آزمایشات کنترل کیفی که نیاز به حیوانات آزمایشگاهی دارند را می توان حذف کرد.(7) منابع : 1) تاج بخش، ایمنی شناسی بنیادی.
انتشارات دانشگاه تهران.
1374 2)تیرزاد، ایان.ترجمه: شیمی، احمد.
ایمنی شناسی دامپزشکی، انتشارات نوربخش.
1380 3)نازک تبار، احمد، بررسی چگونکی تولید آزمایشگاهی واکسن در ایران.
پایان نامه دانشجویی جهت دریافت درجه عمومی دکترای دامپزشکی.
شماره 677 .
دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج.
1383 4) British pharmacopoeia(Veterinary).
(1985) 5)coenraad S.N and H.endrikfen.
labratory animal in vaccine production and control.
kluwer Academic MPC publisher .
chapter 4.
1988 6)coenraad S.N and H.endrikfen.
chapter 3.
1988 7) Http:// www.
vetmed.
Vedavis.
edu/animed - alternatire /vaccines.
htm The Mouse in Science: vaccine.