دانلود گزارش کشت باکتری

تعریف کشت :

هنگامیکه باکتریها در شرایطی مناسب قرار گیرند که قادر به تکثیر و رشد باشند اصطلاحا گفته می شود باکتری کشت داده شده است .

تعریف محیط کشت :

از آنجا که میکروب یک موجود تک سلولی بوده و قادر است کلیه اعمال حیاتی خود را مستقلا انجام دهد بدون آنکه نیاز به سلول دیگری داشته باشد . این اصل بیانگر آن است که میکروبها هم احتیاج به غذا و آب و موادآلی و معدنی دارند. محیطی مغذی که حاوی کلیه احتیاجات یک میکروب اعم از مواد غذایی و عناصر و غیره باشد که موجب رشد آن میکروب شود را اصطلاحا محیط کشت می گویند.

برای مطالعه میکروارگانیسم ها باید بطریقی آنها را بر روی محیطهای مناسب از نظر شرایط فیزیکی و شیمیایی کشت داد . مطالعه زیاد درباره میکروارگانیسم ها و نحوه زندگی آنها باعث شده که تا کنون انواع زیادی از محیط کشت با ترکیبات متفاوت به طور مصنوعی برای استفاده در آزمایشگاههای میکروبیولوژی تهیه شود . هرچند انواع این محیط کشت ها زیاد می باشند، معهذا در مواردی برای کشت نوع بخصوصی از یک میکروارگانیسم باید از یک نوع محیط کشت بخصوص با ترکیبات مشخص استفاده شود.

بطور کلی محیط های کشت باید دارای مشخصات معینی باشند و هنگام تهیه و استفاده از محیط کشتها باید به نکات زیر توجه شود :

تمام محیط کشتها باید واجد مواد غذایی ضروری برای رشد میکروبها باشند

PH محیط کشت باید در حد معین قبل از استفاده برای کشت تنظیم شود.

ظروف مورد استفاده برای تهیه محیط کشتها باید کاملا تمیز و عاری از مواد خارجی باشند .

آب مقطر مورد استفاده باید بطریقه صحیح تهیه شود .

درجه حرارتی که برای استریل کردن محیط کشت مصرف می شود باید نسبت به نوع مواد غذایی مربوط در محیط کشت در نظر گرفته شود . درجات بالا باعث از بین رفتن برخی از مواد شیمیایی موجود در محیط کشت می شوند .

محیط های کشت باکتریها به سه صورت زیر تهیه میشود :

محیط کشت مایع یا آبگوشتی (liquid or broth media)

محیط کشت جامد (solid media)

محیط کشت نیمه جامد (semi solid media)

محیط کشت مایع ( براث ) :

این محیط فاقد آگار و فقط در لوله آزمایش یا فلاسک استفاده میشود . مثل محیط نوترینت براث.

محیط کشت جامد :

این محیط حاوی 5/1 تا 2 درصد ماده آگار است که بعد از سرد شدن منعقد می شود . محیط کشت جامد را درون لوله آزمایش یا پلیت استفاده می کنند.مثل محیط TSI و M.c

دلیل بکارگیری محیط جامد ، تشخیص باکتریها به وسیله :

تشکیل کلنی

تولید پیگمانت

خصوصیات خاص هر کلنی

تشخیص انواع باکتریها که چند نوع باکتری در نمونه میکروبی وجود دارد .

موکوئیدی بودن باکتری

دیدن منطقه همولیز .

محیط کشت نیمه جامد :

این محیط در ترکیب خود مقدار کمی آگار دارد . بنابراین کاملا منعقد نمی شود و نیمه جامد باقی می ماند . مثل محیط SIM .

آگار :

ماده ای پلی ساکاریدی است که از یک نوع جلبک قرمز دریایی تهیه می شود، در c° 95 ذوب و در حرارت c° 42 منعقد می گردد .

محیط های کشت باکتری را از نظر نوع مواد تشکیل دهنده و از نظر کاربرد به چهار دسته تقسیم می کنند:

محیط کشت پایه (Basic Media) :

این محیط کمترین مقدار مواد غذایی برای رشد باکتریها را دارد . و مبنای تهیه انواع و اقسام محیطهای کشت می باشد . اکثر انواع باکتریها در آن رشد می کنند زیرا فاقد ماده ضد میکرب است . مانند محیط نوترینت آگار ، نوترینت براث .

محیط کشت غنی کننده (Enrichment Media) :

محیط مقوی بوده که دارای مواد تغذیه ای زیادی نظیر ویتامین ها ، لیپید ها ،

اسید های آمینه برای رشد باکتری است . بنابراین تعداد زیادی از باکتریها روی آن بخوبی رشد می کنند . مانند شکلات آگار، بلادآگار .

محیط کشت افتراقی (Differential Media) :

محیط کشت تشخیصی بوده که کلنی باکتریهای مختلف روی آن کاملا از همدیگر متمایز می گردد. مانند محیط E.M.B ، M.c این محیطها دارای املاح صفراوی ، قند و معرف شیمیایی هستند که باکتریهای لاکتوز مثبت برروی آنها کلنی های صورتی رنگ و باکتریهای لاکتوز منفی نظیر سالمونلا ، شیگلا بر روی این محیط ها کلنی های سفید رنگ تشکیل می دهند . از محیطهای افتراقی دیگر محیط TSI ، سیمون سیترات را میتوان نام برد . این محیط ها برای رشد باکتریهای گرم – منفی روده ای (انتروباکتریاسه) مناسب هستند . چون وجود املاح صفراوی در محیط مانع از رشد باکتریهای گرم مثبت در محیط می شوند.

محیط کشت اختصاصی (Special Media) :

این محیطها برای رشد باکتریهای خاصی مناسبند . از این محیطها برای ایزوله نوع خاصی از باکتری در یک مخلوط میکربی استفاده می شود . مانند محیط s.s آگار که برای جدا کردن سالمونلا و شیگلا بکار میرود یا مانیتول سالت آگار که برای تشخیص گونه بیماریزای استافیلوکوکوس اورئوس استفاده می شود .

محیط کشت انتخابی : (Selective Media )

محیط هایی وجود دارند که دارای یک ماده مهار کننده رشد می باشند این مواد رشد تمام ارگانیسم ها بجز ارگانیسم مورد نظر را مهارمی کنند . درمرحله اول از رنگ هایی که دارای خواص ضد میکروبی هستند استفاده می شود ودر مرحله بعد استفاده از آنتی بیوتیک ها و مرحله آخر شامل وارد کردن مواد ترکیبی به محیط کشت جهت فعالیتهای متابولیکی ارگانیسم مورد نظر می باشد . از آنجا ئیکه این محیط ها جهت ارگانیسم مورد نظر انتخاب شده اند و برای سایر ارگانیسم ها مضر می باشند آنها را محیط های انتخابی می نامند . مثالی از این نوع محیط ها ، محیط کشت فنیل اتیل الکل آگار است که از رشد باسیل های گرم منفی هوازی و بی هوازی اختیاری ممانعت بعمل آورده و به ارگانیسم های گرم مثبت اجازه رشد می دهد .

طرز تهیه کلی محیط های کشت :

همانطوریکه می دانید محیطهای کشت به سه دسته جامد ، نیمه جامد ، مایع تقسیم می شوند . محیطهای مایع معمولاً فاقد آگار هستند یا مقدار آگارشان بسیار کم است . مثلاً حدود ( 2/0%) و محیط های نیمه جامد دارای مقدار کمی آگار حدود 3- 2 گرم وبالاخره محیط های جامد که دارای 15- 13 گرم آگار در لیتر محیط هستند .

برای ساختن محیط های کشت باکتری، ما از پودر مخصوص که در شیشه های مربوطه قرار دارد، استفاده می‌ کنیم. در روی این شیشه ها ترکیب محیط بطور کامل و همچنین طرز ساختن آن نوشته شده است . مثلاً برای ساختن نوترینت آگار ابتدا مقدار لازم از پودر آن را وزن کرده ودر مقدار معینی آب مقطر که قبلاً در یک ارلن مایر یا بطری ریخته اید اضافی نموده و آنرا کاملاً‌ حل نمائید وسپس با پنبه درب ارلن مایر را مسدود کرده و آن را روی سه پایه چراغ گازی حرارت می‌دهید ، تا زمان جوشیدن آنرا چند بار تکان دهید تا خوب حل شود و بمدت یک دقیقه بجوشد پس از آنکه مایع بجوش آمد ، آنرا برداشته وبا تکه کاغذ آلومینیومی روی پنبه را می‌پوشانید وظرف را در اتوکلاو می‌گذارید تا در فشار 15 پاند بر اینچ مربع و حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استریل شود . بعد از استریل کردن بگذارید تا خنک شود تا حدود c450- 40 . سپس در حالیکه ارلن را در دست راست گرفته و پنبه آنرا با دست چپ کنار شعله خارج کرده‌اید ، دهانه ارلن را یکبار از درون شعله گاز عبور دهید وبعد درون پلیت های استریل شده بین cc20- 15 از محل محلول بریزید . بعد پلیت ها را در کناری بگذارید تا سرد شوند وازتکان دادن آن خودداری نمائید وپس از جامد شدن محیطهای کشت نوترینت آگار را جمع کرده ودر c370 بمدت 24 ساعت قرار دهید . اگر محیط ها آلوده نشده باشند آنها را از c370 بیرون آورده و در یخچال 4 درجه سانتی گراد قرار می‌دهید .

طرز ساختن سایر محیطهای کشت، همینطور می‌باشد منتهی بعضی از محیطهای جامد در لوله مستقیم، پس از جوشاندن ریخته شده و بعد استریل می‌شوند که این محیطها را پس از استریل شدن، به طور ایستاده می‌گذاریم مثل محیط SIM و یا کج می‌گذاریم مثل محیط TSI تا سرد شوند .

برای ساختن محیط مایع (براث) پس از جوشاندن، محیط را در لوله‌ ها تقسیم می‌کنیم و سپس با پنبه‌ای درب آنها را مسدود کرده و جهت استریل داخل اتوکلاو قرار می‌دهیم .

انواع محیط های کشت

محیط های کشت عمده ‌ای که در آزمایشگاه مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از :

محیط نوترینت براث (Nutrient broth ):

این محیط مبنای ساخت اکثر محیطهای کشت است و از عصاره گوشت تهیه می‌شود طرز تهیه آن مثل نوترینت آگار می‌باشد . این محیط بدلیل نداشتن آگار بصورت مایع در لوله آزمایش تهیه می شود .

محیط نوترینت آگار (Nutrient agar):

چنانچه ماده آگار را به نسبت 5/1 تا 2 درصد با آبگوشت غذایی مخلوط کنیم، این آگار غذایی بدست می‌آید . این محیط مبنای تهیه انواع و اقسام محیط های کشت جامد مثل Blood Agar , Chocolate agar می باشد .

محیط آگار خوندار (Blood agar) :

اغلب نمونه های رسیده به آزمایشگاه میکروب شناسی بر روی محیط آگار خوندار کشت داده می‌شوند، چون این محیط از رشد تمام واغلب باکتریهای سخت رشد حمایت کرده و اغلب میکروب شناسان عادت دارند بر اساس مورفولوژی کلنی بر روی آگار خوندار تصمیم گیری نمایند . این محیط از یک محیط پایه مانند تریپتون که منشاء پروتئینی دارد، کلرید سدیم آگار و 5 درصد خون تشکیل شده است . برخی باکتریها آنزیم های خارج سلولی تولیدکرده که بر روی گلبول‌های قرمز عمل کرده و آنها راکاملاً لیز می‌کند (همولیزبتا ) یا یک تغییر سبز رنگ در اطراف کلنی ایجاد می‌کند ( همولیز ناقص یا آلفا ) در صورتی که برخی از باکتریها تغییری ایجاد نمی‌کنند ( همولیزگاما) تولید همولیزین بوسیله باکتری به بسیاری از فاکتورهای محیطی مانند PH ، اکسیژن و دما بستگی دارد. میکروب شناسان اغلب از مورفولوژی کلنی و تولید همولیزین به عنوان آزمایشات غربالگری اولیه جهت کمک به تصمیم در انتخاب مراحل دیگر جهت شناسایی یک باکتری استفاده می‌کنند. جهت مطالعه درست واکنش همولیتیک بر روی آگار خوندار، کارشناس بایستی پلیت را در مقابل نور گرفته و مشاهده نماید. اگر از لوپ جهت کشت خطی بر روی آگار خوندار استفاده می‌شود باید آنرا در آگار فرو برده ( Stabbing) تا ارگانیسم بتواند در زیر سطح محیط که اکسیژن کمتری دارد رشدکند . تولید همولیزین های حساس به اکسیژن در برخی از ارگانیسم ها بدین وسیله تشدید می‌گردد . به روش دیگر، می‌توان پلیت‌ها را جهت مشاهده واکنش همولیزین حساس به اکسیژن به طریق

بی هوازی نیز انکوبه نمود.